Name: HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 배우세요 라이브 공촛점 현미경을 사용하여 HIV의 T세포 간 전달을 시각화하는 방법을. 형광 표지된 HIV 클론과 바이러스학적 시냅스 분석을 통해 세포 간 전염 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 검토는 건강 보조금 국립 연구소, AI074420 - 02, 버로우즈 웰컴의 탐정 수상, BKC에 Hirschl 경력 과학자 수상에 의해 및 Biophotonics 과학 기술에 대한 NSF 센터, 협동 계약 PHY012099, 그리고 TH에 UCD 보건 시스템 연구 수상에 의해 지원되었다 UCD CTSC NCRR ULRR024146.

이 방법에 보고된 연구에 사용된 <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">허브너 외 과학 323 :. 1743년에서 1747년까지 (2009)가</a> . 1. 개요 HIV의 휴대 전화의 전파는 원래 기증자 세포 및 기본 CD4 + 세포 수용체 1,2,3으로 T lymphocytes으로 HIV 감염 Jurkat 세포를 사용하여 설명했다. 이러한 연구에서 바이러스 항체 염색법을 사용하여 고정 세포에서 발견되었다. 라이브 세포에서 세포로 세포에서 바이러스의 전송을 추적하기 위해, 우리는 HIV 개그 - iGFP 4 불리는 HIV의 재조합, 전염성 분자 클론을 이용. 그것은 MA와 CA 도메인 사이의 개그 단백질에 내부 삽입 녹색 형광 단백질 (GFP)을 수행합니다. HIV의 분자 복제는 도우미 바이러스에 대한 필요없이 감염을 유지합니다. 이 클론으로 만든 바이러스 입자는 세포 사이 stoichiometrically 바이러스 조립 및 전송을 모니터 강한 형광 신호를 제공하는 녹색 형광 단백질과 함께로드됩니다. 와 함께 사용하면 불활성 셀 추적 형광 염료를받는 세포가 입력 기증자 세포에서 차별, 그리고 하나는 감염된 T 세포에서 감염되지 않은 T 세포 5 HIV의 전송을 시각화 수 있습니다. 그들은 밀봉, 가스 투과 이미징 챔버에서 양식하는 동안 Virological 버렸네 형성 한 세포에서 다른 바이러스의 전송은 다음 살아있는 세포에서 볼 수 있습니다. (1 일) 2. HIV 개그 - iGFP의 준비 Jurkat T 세포를 Transfected <ol><li> 주의 2 X 10 5, 8 X 10 5 셀 / Jurkat 문화 미디어 (RPMI 1640 10 % 태아 소 혈청에서 ML 사이의 농도에서 세포를 유지하여 인간의 CD4 + T 세포 라인 Jurkat (ATCC, 머내서스, VA)을 준비, 100 단위 / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신). 성공에 열쇠 : 8 X 10 5 세포 / ML을 초과하는 농도의 Jurkat 세포의 문화 transfection 효율의 감소가 발생합니다. 참고 : 아래 설명 HIV 개그 - iGFP proviral DNA T 세포로, 복제 - 유능한 인간 면역 결핍 바이러스의 생산에 결과의 transfection. 따라서, 모든 절차는 인증 biosafety 레벨 2 + 또는 biosafety 레벨 3 (BL2 + / BL3) 조직 문화 룸에서만 교육 연구소 요원에 의해 실시되어야하는 것입니다. 영상 시설 전염성 HIV와 함께이 지역 기관 biosafety 사무소의 승인을 받아야합니다. </li><li> Amaxa의 nucleofection 방식 (Lonza, 워커스빌, MD)를 사용하여 바이러스 플라스미드, HIV의 개그 - iGFP로 Jurkats을 Transfect. 150 10 분 원심 분리하여 펠렛 5 X 10 6 세포 X G. 뜨는을 기음과 멸균 인산의 세포를 세차 호수 (PBS)를 버퍼. 세포를 원심과 제조 업체의 보충을 포함하는 미리 예열, nucleofector 솔루션 V 97 μL로 펠렛을 resuspend. 세포 현탁액에 플라스미드 내독소 무료 HIV 개그 - iGFP (1 μg / μL)의 세 μL를 추가하고 부드럽게 섞는다. 프로그램 S - 18을 사용하여 쿠베트과 nucleofect에 세포 현탁액을 전송합니다. 즉시 항생제없이 prewarmed Jurkat 문화 미디어 3 ML에 세포를 전송합니다. </li><li> virological 시냅스에 대한 CD4 + 대상 세포를 준비하려면, 우리는 표준 Ficoll - Paque (GE 헬스케어, 웁살라, 스웨덴) 프로토콜을 사용하여 버피 외투에서 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포를 구하십시오. CD4 + T 세포는 다음 부정적인 자기 비드 절연 키트 (Miltenyi Biotec, 오번, CA)를 사용 선택됩니다. 이들은 저온 동결 미디어 5 X 10 6 cells/500 μL (90% 태아 소 serum/10 % DMSO)의 aliquots에서 액체 N2에 저장되어있을 수 있습니다. 해동 기본 CD4 + T 세포 10 대 / IL - 2의 ML과 보충 RPMI 10% FBS에 양식 있습니다. </li></ol> (주 2) 3. HIV 개그 - iGFP와 형광 염료와 대상 세포의 스테 이닝과 Transfected Jurkats에서 생방송으로 세포의 복구 <ol><li> Jurkat 세포는 밤새 transfection에서 복구할 수 있습니다. 그런 다음 ficoll의 hypaque 밀도 기울기 원심 분리를 통해 물질에 의해 세포 파편을 제거합니다. 15 ML 원뿔 튜브의 바닥에 Ficoll - Paque 1.5 ML 하는걸. 부드럽게 RPMI의 5 ML 볼륨에서 transfected Jurkats이 그라데이션 자료를 오버레이. 브레이크 해제와 함께 실온에서 20 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 피펫을 사용하여 미디어 / Ficoll 인터페이스에서 세포를 제거합니다. 새로운 15 ML 원뿔 관에게 전송합니다. 10 분 300 XG 15 ML 및 원심 분리기의 총 볼륨 RMPI로 세포를 희석. 잘 2cm (6 잘 플레이트)의 Jurkat 문화 미디어 3 ML에서 펠렛을 Resuspend과 조직 문화 인큐베이터로 세포를 반환합니다. </li><li> 셀 - 셀 전송 실험에서 기증자 세포에서 대상 세포를 구분하기 위해 우리는 CD4를 prelabel + 형광 염료와 대상 세포를. 기본 CD4 + T 세포가도 표시 아르사용하기 전에 주입. 우리는 CellTracker 및 CellTrace의 염료 (Invitrogen, 칼스 배드, CA) 모두 훌륭한 성공 라벨 T 세포를 있었다. 염료 농도 및 배양 시간이 특정 염료 및 사용 세포 종류에 따라 최적화되어야합니다 있지만, 대표적인 프로토콜은 다음과 같습니다. 펠렛 4 X 10 6 주 CD4 + 10 분 400 XG의 회전에 의해 T 세포. PBS 2 ML의 PBS와 resuspend 5 ML있는 세포를 씻으십시오. 1.5 μm의의 최종 농도 CellTracker 오렌지 (CMTMR, Invitrogen, 칼스 배드, CA) 추가 37 20 분 ° C 품어. 전체 Jurkat 미디어 8 ML을 추가하고 10 분 400 XG에 원심 분리기. 10 대 / IL - 2의 ML과 하룻밤 조직 문화 인큐베이터의 장소 보충 전체 미디어 중 3 ML에있는 세포를 Resuspend. </li></ol> (3 일) 4. 라이브 셀 이미징을 사용하여 HIV의 모니터링 휴대 전화 전송 재갈 - iGFP 우리는 일상적으로 HIV 개그 - iGFP transfected Jurkat 세포 48 시간 이후 transfection을 사용합니다. 그러나, 우리는 성공적으로 24시간 빠르면 세포를 사용하여 있고, 72시간 이후 transfection처럼 늦었어요. <ol><li> 약 48 시간 후 transfection, HIV 개그 - iGFP 표현 Jurkats는 CO와 씻은, 계산됩니다 2 독립 미디어 (Invitrogen, 칼스 배드, CA), 그리고 라이브 셀 이미징 미디어 (CO 2 독립 미디어 10 % 태아 소 혈청에서 resuspended 1-3 X 10 7 세포 / ML의 농도 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 10 단위 / ML IL - 2). </li><li> 비슷한 방식으로, 씻고 1-3 X 10 7 셀 / 라이브 셀 이미징 미디어 ML의 농도에 표시된 기본 CD4 + T 세포를 resuspend. </li><li> 기본 CD4 + 대우 조직 문화, 가스 투과, microchamber (Ibidi, 베로나, WI)에 1시 2분 또는 1시 3분 비율 및 부하에서 T 세포와 혼합 HIV는 개그 - iGFP - transfected Jurkats. 예를 들어, 레이블 주 CD4 + T 세포의 40 μL와 HIV 개그 - iGFP transfected Jurkats 20 μL를 섞는다. Ibidi 챔버에이 혼합물의 50 μL를로드하고 플러그와 챔버를 밀봉. parafilm와 플러그 / Ibidi 챔버 인터페이스를 배치하여 플러그를 고정합니다. </li></ol> 5. 현미경 플랫폼을위한 고려 사항 : 스피닝 디스크 공촛점 이미징 전지 Ibidi 이미징 챔버를 로딩 후에, 우리는 즉시 거꾸로 광학 현미경 (iX71 올림푸스, 센터 밸리, PA)에 장치를 탑재합니다. Ibidi 챔버는 적절한 안전 의상을 입고 BL2 + - 교육 실험실 요원에 의해 현미경을 전송해야합니다. 라이브 셀 이미징은 일반적으로 안정적인 37 ° C 환경을 유지하기 위해 고가의 배양 챔버 스를 사용하지만, 이것은 T - 타입 열전대 팁과 함께 간단하고 경제적인 온도 조절 히터를 (ASI 400 Nevtek, 윌리엄스빌, VA)를 사용하여 달성되었습니다 옆에 장착 적정 온도 피드백을위한 샘플. 우리는 2 - 독립 미디어가 CO 2 챔버의 사용을 피하고있는 동안 우리는 높은 세포 생존을 유지할 수있는 CO를 사용하여 찾을 수 있습니다. 방안에 온도 변화에 대한 플랫폼을 버퍼하고 배경 객실 조명을 차단하기 위해 큰 검은 장막이 시스템 주위에 절연 공기 주머니를 만들어 온 현미경 / 히터 설정을 통해 draped 있습니다. 이것은 크게 온도 변화와 관련 온도 관련 샘플 드리프트를 감소하지만, 사전에 샘플을 설치하기 위해 30 분 미리 가열이 필요합니다. 6. 데이터 수집, 전송 및 이미지 프로세싱 이미지는 높은 수치 조리개 (NA) 크게 해상도를 향상과 같은 60x 1.42 NA 오일 침지 목표 (UPlanApo N, 올림푸스)를 사용 찍은 있습니다. 3D 공촛점 이미지를 만들려면, 검사가 동시에 극적으로 검색 속도를 높일 수&gt; 800 공촛점 장소를 사용하는 회전 디스크 공촛점 장치 (CSU - 10, Yokagawa, 일본)에 의해 수행됩니다. 의 속도, CSU - 10 photobleaching과 phototoxicity 모두 감소 빠르고, 낮은 조명 이미징 수 있도록 매우 민감한 전자 - 곱한 충전 - 결합 장치 (EMCCD, iXon + 897, Andor 기술, 아일랜드) 카메라에 대응됩니다. 경의를 표할 형광 광원이 선정하는 원하는 파장 (488 nm의)과 레이저의 파워는 바로 현미경 목표 (&lt;1 MW)하기 전에 측정 멀티 파장 ArKr 이온 가스 레이저 (이노바 70C, 일관된, 산타 클라라)입니다 음향 광학 조정할 수있는 필터 (AOTF), (Andor 기술). 추가 photobleaching 절감 및 총 이미징 시간을 연장하기 위해 빠르게 AOTF은 (마이크로초) 레이저 빔을에게 새로 취득한 이미지가 CCD (15-30 MS 노출)에서 제공하는 동안 카메라 (10-20 MS) 비활성 때마다을 껐다 컴퓨터에. 레이저 빛은 405/488/568/647 쿼드 밴드 이색성 거울 (Semrock, 로체스터, NY)를 사용하여 회전 디스크 시스템에 결합됩니다. 형광 방출이 필터 휠 (Ludl 전자 제품, 호손, NY) 안에 50분의 525 대역 통과 필터 (Semrock)를 사용하여 필터링 장착 BEMCCD 카메라와 공촛점 회전 디스크 장치를 etween. Z - 스테이지 (매드시 연구소, 매디슨, WI)을 포함한 모든 하드웨어 및 인수는, Andor IQ v1.8 소프트웨어에 의해 제어됩니다. 1.2-1.9 주위에 초 3D 이미지 스택에서 인수의 속도를 극대화하기 위해, 우리는 아래로 휴대 쌍의의 즉시 지역에 EMCCD의 카메라의 녹화 영역을 자르기. 또한, Z의 일부 정보의 비용으로, 0.45-0.75 μm의 사이에 큰 Z - 단계는 획득 속도를하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 조건 하에서 영상은 6 시간까지 지속 - 지속적인 20-60 분의 세그먼트를 사용하여 - 최소한의 photobleaching과 함께. 모두 각 데이터 세그먼트는 일반적으로 이미지의 수만을 가져옵니다 같은 공간의 5-20 GB를 가득 메우고 있습니다. 대용량 데이터 파일의 전송 및 분석을 촉진하기 위해 각 인수 세트 세분화하고 Andor IQ v1.8 소프트웨어를 사용하여 1 GB TIFF 이미지 파일을 세그먼트로 내보낼 수 있어야합니다. 여기에서 많은 우수한 소프트웨어 패키지는 Metamorph, Volocity 및 ImageJ (우리는 변화 피지를 권장합니다)와 같은 이미지 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 이 형광 마커가 추적해야하는 경우, 우리는 동시에 사용하여 인수를 늦추고없이 모두 기록 &quot;분할 화면 모드를.&quot; 두 마커는 한 번에 두 개의 서로 다른 ArKr 레이저 라인 (보통 488와 568 nm의)에 의해 기쁘게 생각합니다. EMCCD 카메라가 두 개의 다른 이미지를 분리 이미지 스플리터 (OptoSplit II, 케언, 켄트, 영국)되기 전에 직접 삽입. 각각의 이미지가 독립적으로 한 번 &#39;분할 화면&#39;효과를 만드는 카메라에 형광 필터 (Semrock)와 예상되는 side - by - side를 사용하여 필터링됩니다. 이것은 다음 수동 자르기 이상의 이미지 프로세싱에서 이미지의 정렬을 필요로합니다. 7. 이미지 처리 및 데이터 분석을위한 고려 사항 우리는 일반적으로 매킨토시 컴퓨터에 Volocity (PerkinElmer, 월섬, MA) (애플, 병원)과 이미지 분석을 수행합니다. 스피닝 디스크 레이저 공촛점 현미경 이미지는 처음엔 Volocity와 deconvolved, photobleaching에 대해 올바른 자신의 강도 조정됩니다. 개그 puncta의 강도 측정 및 추적은 Volocity의 부량 모듈로 수행됩니다. 미리 구성된 버렸네에 상대적인 움직임이 계산해야 할 이미지 집합에 대한, 자동 추적 알고리즘은 전체 시퀀스에 걸쳐 신경 버튼을 추적하는 고용이다. autotracking 소프트웨어에 의해 정의된 관심 영역의 수동 검사는 소프트웨어가 올바르게 원하는 객체를 추적 것을 확인하기 위해 수행되어야합니다. 주변 물체와 대비가 너무 약한 객체에 대한 수동 추적 프레임으로 프레임 단위로 수행할 수 있습니다. Volocity 소프트웨어 패키지는 원하는 개체 내에서 XYZ 위치, 볼륨 및 통합 신호의 수출을 허용합니다. 추적할 개체의 버렸네과 속도에서 거리는 시냅스 단추의 중심에 움직임을 정규화하여 계산됩니다. 8. 대표 결과 혼합의 10 ~ 15 분 내에 하나는 기본 CD4을 준수하는 HIV 개그 - iGFP 표현 Jurkat 세포 + T 세포를 시각화 할 수 있어야합니다. 이미징 이러한 conjugates는 하나는 감염된 세포뿐 아니라 synaspe 후 대상 세포의 개그 puncta의 움직임을 평가할 수 있습니다. 시냅스가 형성되면 하나는 곧 대상 세포에 개그 - iGFP의 puncta의 움직임을 관찰 수 있습니다.

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 여기서 세포 세포에서 HIV의 전송을 시각화를위한 간단한 방법을 설명합니다. 저희 연구실과 다른 &#39;에서 최근 연구는이 T 세포 사이에 확산 HIV의 주된 모드있을 것입니다. 방법은 여기에 설명된 HIV의 재조합 형태를 채용, 핵심 구조 단백질, 개그의 유전자 인코딩 녹색 형광 단백질 태그를 실시 개그 - iGFP, HIV를했다. 때문에 각각의 바이러스 입자의 생산 GFP의 높은 수준, HIV의 복제 - 유능한 복제가 실시간으로 각각의 바이러스 입자를 추적하기 위해 연구자 수 있습니다. 이 바이러스는 HIV의 조립 및 셀 셀 전송에 관한 연구에 특히 유용합니다. 셀 - 셀 전송에 의해 HIV의 전송이 매우 효율적입니다. 3 시간 동안 공동의 문화, 우리가 일상이 유동세포계측법에 의해 평가와 같은 바이러스가 기본 T 세포의 20-30%로 전송을 참조하십시오. 비슷한 효율성은 질적 라이브 셀 이미징 동안 볼 수 있습니다. Virally 감염된 T 세포가 거의 즉시 공동 문화의 개시 이후에 감염되지 않은 기본 T 세포와 시냅스 형성을 시작합니다. 흥미, 모든 기본 T 세포가 레이저 핀셋 (게시되지 않은 관찰, GM)와 강제로 상호 작용에도 불구하고 HIV에 감염된 Jurkat 세포와 상호 작용이 가능합니다. HIV 개그 - iGFP은 의심의 여지없이 체외 및 생체내 세포 모두에서 세포 전송에 가장 민감한 T 세포 하위 집합을 결정하는 데 유용합니다.

<table><tbody><tr><td>Jurkat T 세포</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>전혈 유래 백혈구 버피 코트</td><td>뉴욕 혈액 센터(New York Blood Center)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소태아혈청</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 시스템 및 Solution V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Prep 키트</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV Gag-iGFP 플라스미드</td><td>Chen 연구실</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD4+ T 세포 분리 키트</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celltracker/CellTrace 염료</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>일산화탄소&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-독립 배지</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이미징 챔버</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 도립현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlanApo N 1.42NA 60X 오일 대물렌즈</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C ArKr 이온 가스 레이저</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-10 니프코(Nipkow)형 스피닝 디스크 공초점 유닛</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 다이크로익 빔스플리터</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>525/50 밴드패스 필터</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon+ 897 전자 증배 전하결합소자(EMCCD) 카메라</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ASI 400 항온 가열기</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hiv와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 hiv의 머릿속 휴대 전화 전송

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

융합 자신이 좋아하는 단백질에 녹색 형광 단백질로, 생물학 자 이제 형광 영상 현미경을 사용하여 복잡한 세포 프로세스를 살아있는 공부를하는 기능이 있습니다. 인간 면역 결핍 바이러스의 휴대 전화 전송하는 동안 인간 면역 결핍 바이러스 핵심 단백질의 움직임을 추적하려면, 우리는 HIV의 감염 분자 복제의 컨텍스트에서 개그 단백질, HIV 개그 - iGFP라는 GFP가 - 태그있다. 우리는 비디오 공촛점 현미경을 사용하여이 바이러스 복제를 공부합니다. 다음과 같은 시각 실험에서, 우리는 HIV 개그 - iGFP와 인간의 T 세포 라인을 transfect, 우리는 찬란 분류 감염되지 않은 CD4 + T 세포 바이러스에 대한 대상 세포 역할을 사용합니다. 우리가 쉽게 세포 구조를 통해 바이러스 생산과 운송에 따라 서로 다른 형광 라벨을 사용하면 virological 시냅스라고. 단순 가스 투과 이미징 챔버 스는 우리가 일 분 라이브 공촛점 현미경과 시냅스를 관찰할 수 있습니다. 이러한 방법들은 하나의 세포에서 다음에 이동 바이러스성 단백질을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

이 시각 실험 라이브 공촛점 이미징 실험에 대한 HIV의 형광 분자 클론을 활용을위한 가이드입니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

생물학자들은 녹색 형광 단백질을 관심 단백질에 융합시킴으로써, 이제 ...을 이용하여 살아있는 복잡한 세포 과정을 연구할 수 있는 능력을 갖추게 되었습니다.

이 절차는 살아있는 세포 이미징을 통해 HIV 발현 jerk CAT T 세포와 감염되지 않은 일차 T 세포 사이의 바이러스 시냅스를 통한 GFP 표지 HIV의 전이를 시각화합니다. 세포 간 전이 분석은 HIV one의 감염성 형광 클론인 HIV gag IG FP로 jerk CAT T 세포를 형질전환하는 것으로 시작하며, 형질전환된 jerk cat 세포는 HIV gag IG FP를 발현합니다. 그 후, 이 세포들을 C-M-T-M-R로 표지된 감염되지 않은 일차 T 세포와 혼합하여 이미징 챔버에 로딩하며, 여기서 바이러스 시냅스를 통한 GFP 표지 HIV의 전이를 관찰할 수 있습니다.결과 데이터는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하며, 이를 통해 T세포 바이러스 시냅스를 통한 HIV 전이의 세부 사항을 밝힙니다. 안녕하세요, 저는 마운트 시나이 의과대학 내과 벤 첸(Ben Chen) 연구실의 벤자민 데일(Benjamin Dale)입니다. 저는 UC 데이비스 의료 센터의 NSF 바이오포토닉스 센터 내 토마스 휴저(Thomas Huser) 박사 연구실의 그렉 맥너니(Greg McNerney)입니다.저는 Thomas Huser 박사님 연구실의 Deanna Thompson입니다. 오늘은 라이브 컨포컬 현미경을 사용하여 HIV-1의 세포 간 전이를 시각화하는 절차를 보여드리겠습니다. 이 절차에서는 Jurkat 세포에 감염성 HIV-1 분자 클론을 형질전환하며, 인증된 생물안전 시설에서 근무하는 숙련된 실험실 인원만이 수행해야 합니다.생물안전등급 2+ 또는 3(BSL-3) 수준의 조직 배양실에서 본 프로토콜을 수행할 수 있습니다. 영상 시설 내에서 감염성 HIV를 다루는 작업은 반드시 해당 기관의 생물안전위원회(institutional biosafety office)의 승인을 받아야 합니다. 공여 세포로 사용할 jerk cat 세포는 2 × 10⁵에서 8 × 10⁵ cells/mL 사이의 농도로 유지하십시오.jerk cat 배양에서 배지 세포 농도가 8 × 10⁵ cells/mL을 초과하면 형질전환 효율이 감소합니다. 절차를 시작하려면, 동봉된 서면 프로토콜에 설명된 amax nucleo affection 방법을 사용하여 5 × 10⁶개의 jerk cat 세포에 바이러스 플라스미드인 HIV gag IGFP를 형질전환하고, 세포를 하룻밤 동안 회복시킵니다. 말초혈액 단핵구는 FICO 밀도 구배 원심분리법을 통해 전혈의 버피코트(buffy coats)로부터 정제합니다.CD4 양성 T 세포 분리 키트를 이용한 음성 선택법(negative selection)을 통해 말초혈액 단핵세포로부터 일차 CD4 양성 T 세포를 정제합니다. 음성 선택된 CD4 양성 T 세포를 자성 컬럼에서 수집하여, 10 U/mL의 재조합 인간 IL-2가 첨가된 10% FPS 함유 PMI 배지에서 배양합니다. 분리된 일차 CD4 양성 T 세포를 소분하여 극저온 냉동 보관 용기를 이용해 동결할 수도 있습니다. 냉동 용기는 -70 °C 냉동고에 최소 3~4시간 동안 보관합니다.그 다음 세포들을 액체 질소로 옮겨 장기 보관합니다. Jurkat 세포의 형질전환과 표적 primary CD4 양성 T 세포의 분리가 완료되었으므로, 형질전환 다음 날 세포의 세척 및 라벨링 단계를 진행하십시오. 이제 Jurkat 세포는 감염성 형광 HIV 컨스트럭트를 발현하고 있습니다.감염성 시료를 다룰 때는 앞단추형 실험복을 착용하고 장갑을 두 겹으로 낍니다. fial high pack density 배지를 이용한 원심분리를 통해 형질전환된 세포에서 세포 잔해를 제거합니다. 먼저 15 milliliter 원뿔형 튜브 바닥에 fial pack 1.5 milliliters를 분주합니다.그다음 PMI 배지 5 mL 부피에 형질전환된 jerk hat 세포를 넣어 그라디언트 물질 위에 조심스럽게 층을 덮습니다. 이 시점에서 형질전환된 jerk hat 세포는 감염성 HIV를 생성할 수 있습니다. 따라서 HIV를 발현하는 세포와 접촉한 모든 피펫 팁은 10% bleach 용액으로 소독해야 합니다.생물안전작업대(biosafety cabinet) 내의 수거함에 버리기 전, 튜브의 캡을 닫고 튜브 외부에 70% ethanol 용액을 뿌린 후 마른 kim wipe로 닦아냅니다. 상온에서 브레이크 기능을 끈 상태로 400 Gs에서 20분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리가 끝나면 피펫을 사용하여 배지-세포 층 경계면에서 세포를 조심스럽게 제거하여 새로운 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포를 PMI 배지로 희석하여 총 부피를 15 milliliters로 맞춘 후, 300 GS에서 10분 동안 원심분리합니다.실온에서 펠렛을 3 mL의 jerk hat 배양 배지에 현탁하여 6-웰 플레이트의 2 cm 웰로 옮깁니다. 다음 날 사용할 때까지 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 보관합니다. 같은 날 저녁, 공여 세포와 구별하기 위해 표적 세포로 사용될 일차 CD4 양성 T 세포에 라벨을 붙입니다. 먼저, 일차 CD4 양성 T 세포 4 × 10⁶개를 400 ×g에서 10분 동안 원심 분리하여 펠렛화합니다.그런 다음 5 mL의 PBS로 세포를 세척하고 2 mL의 PBS에 다시 현탁합니다. CellTracker Orange를 최종 농도 1.5 µM이 되도록 첨가하고 37 °C에서 몇 분 동안 배양합니다. 세포 배양이 완료되면 8 mL의 완전한 Cika 배지를 첨가하고 400 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다.10 units/mL의 IL-2가 첨가된 완전 배지 3mL에 세포를 재부유시키고 조직 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 공여 세포와 표적 세포는 세포 간 전이 실험을 위한 준비가 완료됩니다. 세포 간 전이 실험을 설정하기 전, 실내 온도 변화로부터 플랫폼을 보호하기 위해 이미징 챔버를 준비합니다.그리고 실내 배경광을 차단하기 위해, 현미경 가열 설정 전체에 커다란 검은색 덮개를 씌워 시스템 주변에 단열된 공기층을 형성합니다. 이미징 챔버는 샘플 옆에 배치된 T형 열전대 팁을 통해 온도를 피드백 받는 항온 가열기를 사용하여 37 °C의 안정적인 온도로 유지합니다. 샘플을 장착하기 전 30분 동안 예열하십시오.도립 광학 현미경을 이용한 스피닝 디스크 공초점 이미징을 통해 HIV의 세포 간 전이에 대한 3D 공초점 영상을 생성합니다. Z 스테이지를 포함한 모든 하드웨어 및 획득 과정은 IQ version 1.8 소프트웨어로 제어됩니다. 스캐닝은 CS U 10 스피닝 디스크 공초점 장치로 수행되며, 이 장치는 800개 이상의 공초점 스폿을 동시에 사용하여 스캔 속도를 획기적으로 높임으로써 속도를 보완합니다. CS U 10은 고감도 전자 증배 전하결합소자(EMCCD) 카메라와 결합되어 빠른 저광량 이미징을 가능하게 하며, 이를 통해 광퇴색과 광독성을 모두 줄여줍니다.형광 광원은 다파장 아르곤 크립톤 이온 가스 레이저입니다. 원하는 파장을 선택하기 위해 AOTF(Acousto-Optic Tunable Filter)를 사용하며, 여기서는 488 nanometers와 568 nanometers를 선택하고 광출력을 제어하여 광퇴색을 더욱 줄이고 이미징 시간을 연장합니다. AOTF는 카메라가 이미지를 획득하지 않는 각 15 to 30 millisecond 노출 이후에 레이저 셔터를 빠르게 닫아, E-M-C-C-D 카메라에서 컴퓨터로 이미지가 전송되는 동안 불필요한 노출을 방지합니다.레이저 광은 405, 488, 561, 647 nm 쿼드 밴드 이색 거울(Dichroic mirror)을 통해 스피닝 디스크 시스템으로 통합됩니다. 형광 방출광은 이미지 스플리터와 560 nm 롱패스 이색 거울을 사용하여 파장별로 분리됩니다. 녹색 채널은 525/50 nm 밴드패스 필터로 필터링하며, 적색 채널은 609/54 nm 밴드패스 필터로 필터링합니다. 두 채널은 EMCCD 카메라의 이미지 상에 나란히 투영됩니다.이미징 챔버가 예열되는 동안, 세포 간 전이 실험을 위해 세포를 준비합니다. 헤모사이토미터를 사용하여 HIV gag IGFP를 발현하는 ette 세포 수를 측정하십시오. 바이러스 발현 세포에 직접 노출되는 것을 방지하기 위해 헤모사이토미터를 페트리 접시에 넣으십시오.이산화탄소 독립 배지로 세포를 세척한 후, ml당 1~3×10⁷ cells의 농도가 되도록 살아있는 세포 이미징 배지에 재현탁합니다. 이산화탄소 독립 배지를 사용하면 이산화탄소 환경 챔버가 필요하지 않습니다. 이미징을 위해.또한, 앞서 Jurkat 세포에서 수행한 것과 동일하게 라벨링된 일차 CD4 양성 T 세포의 수를 측정하고, 세척 후 재현탁합니다. 다음으로, 세포 간 전이를 개시하기 위해 HIV gag IGFP가 형질전환된 Jurkat 세포 20 µL와 라벨링된 일차 CD4 양성 T 세포 40 µL를 혼합하고, 조직 배양 처리된 가스 투과성 EBD 마이크로 챔버에 50 µL를 로딩합니다. 플러그로 챔버를 밀봉하고, 플러그와 EBD 챔버의 접합부를 파라필름으로 감싸 플러그를 고정합니다.70% ethanol을 적신 화학용 와이프(chem wipe)로 이미징 챔버를 닦아낸 후 후드 내에서 잠시 자연 건조시킵니다. 우발적인 노출을 방지하기 위해 밀폐된 컨테이너에 담아 밀봉된 이미징 챔버를 운반하십시오. IBD 이미징 챔버에 세포를 로딩한 직후 운반 중에 챔버를 떨어뜨리지 않도록 주의하며, 장치를 현미경에 장착하십시오.3D 이미지 스택당 획득 속도를 극대화하기 위해 해상도를 크게 향상시키는 60 x 1.42 NA 오일 침수 대물렌즈를 사용하여 세포 쌍의 이미지를 촬영하십시오. EM CD 카메라의 기록 영역을 세포 쌍의 인접 영역으로 크롭하십시오. 또한, 이러한 조건에서는 0.45에서 0.75 micrometers 사이의 큰 Z step을 설정하는 것이 획득 속도를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.이미지는 20분에서 60분 간격으로 계속해서 기록됩니다. 동일한 샘플 지점을 반복적으로 촬영할 경우, 획득 시 광퇴색(photo bleaching)을 최소화하면서 최대 6시간까지 연장할 수 있습니다. 각 데이터 세그먼트는 수만 장의 이미지로 구성되며, 총 5GB에서 20GB의 용량을 차지할 수 있습니다.대용량 파일의 전송 및 분석을 용이하게 하기 위해, 각 파일은 1GB 단위의 TIFF 이미지 파일 세그먼트로 분할하여 내보냅니다. 획득한 이미지를 분석하려면 여러 이미지 분석 소프트웨어 프로그램 중 하나를 사용하십시오. 강도 표백 교정(intensity bleach correction) 및 gag puncta의 자동 및 수동 추적을 포함한 이미지 분석에 대한 자세한 내용은 함께 제공되는 서면 프로토콜을 참조하십시오.혼합 후 10~15분 이내에 HIV gag IGFP를 발현하는 jerk cat 세포가 일차 CD four 양성 T 세포에 부착되는 것을 이미징으로 확인할 수 있습니다. 이러한 접합체를 통해 감염된 세포뿐만 아니라 표적 세포 내의 gag puncta 이동을 평가할 수 있습니다. 시냅스 형성 후 30분에서 3시간 이내에, cell tracker로 라벨링된 표적 세포 내부로 gag IG FP puncta가 이동하는 것을 관찰할 수 있습니다.지금까지 T-세포 간의 HIV 세포 간 전이를 시각화하는 방법을 살펴보았습니다. 이러한 절차를 수행할 때, HIV 발현 세포에 노출된 시료를 취급하는 경우에는 모든 생물안전 2등급 플러스(BSL-2+) 또는 생물안전 3등급(BSL-3) 예방 조치를 준수하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 형질전환을 최적화하기 위해 잘 관리된 JCA 세포와 엔도톡신 프리 DNA를 사용하시기 바랍니다.이상입니다. 시청해주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합 기술은 시각화, 매핑 및 분석들은 바이러스에 감염된 대상으로 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포의 공간적 근접의 이러한 면역 effectors와 대상 사이의 양적 관계의 결정을 가능하게 감염 결과 수 있습니다.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

우리는 태트 - 응답성 LTR 이외에, 가지고 lentiviral 벡터를 개발, HIV - 1 태트 및 레브 종속적인 방식으로 기자의 유전자 발현을 조절 할 수 레브 - 반응 요소 (RRE). 벡터는 GFP의 표현을 통해 살아있는 세포에서 HIV 복제의 구체적인 검색을 허용합니다.

그린 형광 단백질을 표현 레브 종속 Lentiviral 벡터를 사용하여 HIV - 1 양성 세포의 특정 마킹

이 문서는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경에 의한 유리를 지원 평면 bilayers에서 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다. 메소드는 또한 HIV-1 봉투 유발 virological 시냅스 형성시 발생하는 신호 전달 분자의 활성화 및 재배포를 탐지하기 immunofluorescence 염색법과 결합 할 수 있습니다.

의 이미징 HIV-1 봉투 유발 Virological 시냅스와 합성 지질 Bilayers에 신호

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

2. 핵 염색: 면역염색 후 핵을 대조 염색한다. PBST를 따라내고 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 또는 선택한 핵 염색제를 실온에서 1분 동안 처리한다. 슬라이드를 PBS로 실온에서 흔들어주며 10분 동안 2회 세척한다. Shah, R., 등바이러스 핵산 및 단백질 시각화와 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염 모니터링을 위한 단일 세포 다중 형광 이미징. J. Vis. Exp. (2020)이 영상에서는 분지형 DNA 하이브리다이제이션과 면역형광법을 사용하여 감염된 인간 림프구 내의 HIV-1 DNA, RNA 및 캡시드 단백질을 동시에 시각화함으로써, 개별 세포 내에서 바이러스 복제 단계에 대한 상세한 분석이 가능함을 보여줍니다.

감염된 인간 림프구 내 바이러스 핵산 및 단백질의 다중 형광 이미징

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

alphaherpes 바이러스 감염의 라이브 셀 이미징 직접 수송 및 간 스프레드의 동적 이벤트 분석을 할 수 있습니다. 여기, 우리는 차 신경의 감염시 바이러스 어셈블리의 시각화를 촉진하기 위해 형광 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 변종을 활용 방법론을 제시한다.

Alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

여기서, 우리는 나노 유체 장치에 있는 급성 사건 및 생산적인 HIV-1 감염을 위해 단 하나 세포가 감시되는 프로토콜을 제시합니다. 이미징 데이터는 바이러스 호스트 수용체 상호 작용 및 신호 경로 역학을 정의합니다. 이것은 나노 유체 고처리량 종방향 단세포 배양 및 이미징을 위한 첫번째 방법이다 운동및 분자 상호 작용을 연구하기 위하여.

다중 매개 변수 광유체 플랫폼을 사용하여 칼슘 유입 및 HIV-1 감염의 단세포 특성화

배우세요 라이브 공촛점 현미경을 사용하여 HIV의 T세포 간 전달을 시각화하는 방법을. 형광 표지된 HIV 클론과 바이러스학적 시냅스 분석을 통해 세포 간 전염 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

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