HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

본 절차에서는 살아있는 세포 이미징(live cell imaging)을 사용하여 HIV를 발현하는 jerk CAT T 세포와 감염되지 않은 일차 T 세포 사이의 바이러스학적 시냅스(virological synapse)를 통해 GFP 표지 HIV가 전달되는 과정을 시각화합니다. 세포 간 전달 분석은 HIV 1의 감염성 형광 클론인 HIV gag IG FP를 이용하여 jerk CAT T 세포를 형질전환하는 것으로 시작하며, 형질전환된 jerk cat 세포는 HIV gag IG FP를 발현합니다. 이후 이 세포들을 C-M-T-M-R로 표지된 감염되지 않은 일차 T 세포와 혼합하여 이미징 챔버에 넣고, 바이러스학적 시냅스를 통한 GFP 표지 HIV의 전달을 관찰합니다.

결과 데이터는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하여 T세포 바이러스학적 시냅스를 통한 HIV 전이의 세부 사항을 밝힙니다. 안녕하세요, 저는 마운트 시나이 의과대학 내과 벤 첸 교수 연구실의 벤자민 데일입니다. 저는 UC 데이비스 의료 센터의 NSF 바이오포토닉스 센터 토마스 휴저 박사 연구실의 그레그 맥너니입니다.

저는 Thomas Huser 박사님 연구실의 Deanna Thompson입니다. 오늘은 라이브 컨포컬 현미경을 이용하여 HIV-1의 세포 간 전이를 시각화하는 절차를 보여드리겠습니다. 이 절차에서는 Jurkat 세포에 감염성 HIV-1 분자 클론을 형질전환하며, 인증된 생물안전 시설에서 근무하는 숙련된 실험실 인원만 수행해야 합니다.

생물안전 2등급(BSL-2+) 또는 3등급(BSL-3) 조직 배양실에서 본 프로토콜을 수행할 수 있습니다. 영상 시설 내에서 감염성 HIV를 취급하는 작업은 반드시 해당 기관의 생물안전위원회(biosafety office)로부터 승인을 받아야 합니다. 공여 세포로 사용할 jerk cat 세포를 mL당 2×10⁵에서 8×10⁵ cells 사이의 농도로 유지하십시오.

jerk cat 배양 시, 배지 내 세포 농도가 8 × 10⁵ cells/mL를 초과하면 형질전환 효율이 감소합니다. 절차를 시작하기 위해, 동봉된 서면 프로토콜에 기술된 amax nucleo affection 방법을 사용하여 5 × 10⁶개의 jerk cat 세포에 바이러스 플라스미드 HIV gag IGFP를 형질전환하고, 세포를 하룻밤 동안 회복시킵니다. 말초 혈액 단핵구는 FICO 밀도 구배 원심분리법을 통해 전혈의 버피코트(buffy coat)로부터 정제합니다.

CD4 양성 T 세포 분리 키트를 이용한 음성 선택법으로 말초혈액 단핵구에서 일차 CD4 양성 T 세포를 정제합니다. 음성 선택된 CD4 양성 T 세포를 자성 컬럼에서 수집하여 10 units/mL의 재조합 인간 IL-2가 첨가된 10% FPS 함유 PMI 배지에서 배양합니다. 분리된 일차 CD4 양성 T 세포를 소분하여 냉동 보관 용기를 사용하여 동결할 수도 있습니다. 냉동 보관 용기는 -70 °C 냉동고에 최소 3~4시간 동안 보관합니다.

그 후 세포를 액체 질소로 옮겨 장기 보관합니다. Jurkat 세포의 transfection과 표적 일차 CD4 양성 T 세포의 분리가 완료되었으므로, transfection 다음 날에 세포의 정제 및 라벨링 단계를 진행하십시오. 이제 Jurkat 세포는 감염성 형광 HIV 구조체를 발현하고 있습니다.

감염성 시료를 취급할 때는 앞지퍼형 실험복을 착용하고 장갑을 두 겹으로 낍니다. fial 고밀도 층분리 매질을 이용한 원심분리를 통해 형질전환된 세포에서 세포 잔해를 제거합니다. 먼저 15 mL 코니컬 튜브 바닥에 fial pack 1.5 mL를 분주합니다.

그런 다음 5 mL 부피의 PMI 배지에 transfection된 jerk hat 세포를 넣어 gradient 물질 위에 조심스럽게 층을 형성합니다. 이 시점에서 transfection된 jerk hat 세포는 감염성 HIV를 생성할 수 있습니다. 따라서 HIV 발현 세포와 접촉한 모든 피펫 팁은 10% 표백제 용액으로 소독해야 합니다.

생물안전작업대 내의 폐기 용기에 버리기 전, 튜브 캡을 닫고 튜브 외부를 70%ethanol 용액으로 분사한 후 마른 kim wipe로 닦아냅니다. 상온에서 브레이크를 끈 상태로 400 Gs에서 20분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리 후, 피펫을 사용하여 배지와 세포의 경계면에서 세포를 조심스럽게 제거하여 새로운 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. PMI 배지를 사용하여 세포를 총 부피 15 milliliters가 되도록 희석하고 300 GS에서 10분 동안 원심분리합니다.

실온에서 펠렛을 3 mL의 JERK HAT 배양 배지에 현탁하여 6-웰 플레이트의 2 cm 웰로 옮깁니다. 다음 날 사용할 때까지 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 보관합니다. 같은 날 저녁에, 공여 세포와 구별하기 위해 표적 세포로 사용될 일차 CD4 양성 T 세포를 라벨링합니다. 먼저, 6개의 일차 CD4 양성 T 세포 중 4 × 10⁶개를 400 ×g에서 10분 동안 원심 분리하여 펠렛화합니다.

그런 다음 5 mL의 PBS로 세포를 세척하고 2 mL의 PBS에 재현탁합니다. CellTracker Orange를 최종 농도 1.5 μM이 되도록 첨가하고 37 °C에서 몇 분간 배양합니다. 세포 배양이 완료되면 8 mL의 완전한 chica 배지를 넣고 400 ×g에서 10분 동안 원심 분리합니다.

10 units/mL의 IL-2가 첨가된 완전 배지 3 mL에 세포를 재현탁하고 조직 배양 배양기에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다. 하룻밤 배양 후, 공여 세포와 표적 세포는 세포 간 전이 실험을 위한 준비가 완료됩니다. 세포 간 전이 실험을 설정하기 전, 실내 온도 변화로부터 플랫폼을 보호하기 위해 이미징 챔버를 준비합니다.

그리고 실내 배경광을 차단하기 위해, 전체 현미경 가열 장치 위에 커다란 검은색 덮개를 씌워 시스템 주변에 단열된 공기층을 형성합니다. 이미징 챔버는 온도 피드백을 위해 샘플 옆에 배치된 T형 열전대 팁이 달린 항온 가열기를 사용하여 37 °C의 안정적인 온도로 유지됩니다. 샘플을 장착하기 전 30분 동안 예열하십시오.

도립 광학 현미경을 이용한 회전 디스크 공초점 이미징을 통해 HIV의 세포 간 이동에 대한 3D 공초점 이미지를 생성합니다. Z 스테이지를 포함한 모든 하드웨어와 데이터 획득은 IQ version 1.8 소프트웨어로 제어하며, 스캔은 800개 이상의 공초점 스폿을 동시에 사용하여 스캔 속도를 획기적으로 높인 CS U 10 회전 디스크 공초점 장치에 의해 수행됩니다. CS U 10은 고감도 전자 증배 전하결합 소자(charge coupled device) 카메라와 결합되어 빠른 저조도 이미징이 가능하며, 이를 통해 광퇴색과 광독성을 모두 줄일 수 있습니다.

형광 광원은 다파장 아르곤 크립톤 이온 가스 레이저입니다. 원하는 파장을 선택하기 위해 AOTF(Acousto-Optic Tunable Filter)를 사용하며, 본 실험에서는 488 nanometers와 568 nanometers를 선택함과 동시에 출력을 조절하여 광퇴색을 줄이고 이미징 시간을 연장합니다. AOTF는 카메라가 이미지를 획득하지 않는 각 15 to 30 millisecond 노출 이후 레이저를 빠르게 차단하여, E-M-C-C-D 카메라에서 컴퓨터로 이미지가 전송되는 동안 불필요한 노출을 방지합니다.

레이저 광은 405, 488, 561, 647 nm 쿼드 밴드 이색 거울(Dichroic mirror)을 통해 스피닝 디스크 시스템으로 도입되며, 형광 방출광은 이미지 분할기가 포함된 560 nm 롱패스 이색 거울을 사용하여 파장별로 분리됩니다. 녹색 채널은 525/50 nm 밴드패스 필터로 필터링하고, 적색 채널은 609/54 nm 밴드패스 필터로 필터링합니다. 이렇게 분리된 두 채널은 EMCCD 카메라에 나란히 투영됩니다.

이미징 챔버가 예열되는 동안, 세포 간 전이 실험을 위한 세포를 준비하십시오. 혈구계수기(hemocytometer)를 사용하여 HIV gag IGFP를 발현하는 ette 세포의 수를 측정하십시오. 바이러스 발현 세포에 직접 노출되는 것을 방지하기 위해 혈구계수기를 페트리 접시에 넣으십시오.

이산화탄소 독립 배지로 세포를 세척하고, 밀리리터당 1~3 × 10⁷ cells 농도의 살아있는 세포 이미징 배지에 다시 현탁합니다. 이산화탄소 독립 배지를 사용하면 이산화탄소 환경 챔버가 필요하지 않습니다. 이미징을 위해.

마찬가지로 표지된 일차 CD4 양성 T 세포를 계수, 세척 및 재현탁합니다. 다음으로 세포 간 전이를 시작하기 위해, HIV gag IGFP가 형질전환된 Jurkat 세포 20 µL와 표지된 일차 CD4 양성 T 세포 40 µL를 혼합하고, 이를 조직 배양 처리된 가스 투과성 EBD 마이크로 챔버에 50 µL 로드합니다. 플러그로 챔버를 밀봉하고 파라필름으로 플러그와 EBD 챔버 인터페이스를 감싸 플러그를 고정합니다.

70% ethanol을 적신 화학용 와이프로 이미징 챔버를 닦아낸 후, 후드 내에서 잠시 자연 건조합니다. 우발적인 노출을 방지하기 위해 밀봉된 이미징 챔버를 밀폐 용기에 넣어 운반하십시오. IBD 이미징 챔버에 세포를 로딩한 직후 운반 중에 챔버를 떨어뜨리지 않도록 주의하며, 장치를 현미경에 장착합니다.

60 x 1.42 NA 오일 침수 렌즈를 사용하여 세포 쌍의 이미지를 촬영합니다. 높은 수치 조리개 값은 해상도를 크게 향상시켜 3D 이미지 스택당 획득 속도를 극대화합니다. EM CD 카메라의 기록 영역을 세포 쌍의 인접 구역으로 잘라냅니다. 또한, 이러한 조건에서는 0.45에서 0.75 micrometers 사이의 큰 Z-스텝을 설정하는 것이 획득 속도를 높이는 데 도움이 될 수 있습니다.

이미지는 20분에서 60분의 간격으로 연속적으로 기록됩니다. 동일한 시료 지점을 반복적으로 촬영할 경우, 이미지 획득 시 광퇴색이 최소화된다면 최대 6시간까지 연장될 수 있습니다. 각 데이터 세그먼트는 수만 장의 이미지로 구성되며, 전체 용량은 5GB에서 20GB에 이를 수 있습니다.

대용량 파일의 전송과 분석을 용이하게 하기 위해, 각 파일은 1GB 단위의 TIFF 이미지 파일 세그먼트로 분할하여 내보냅니다. 획득한 이미지를 분석하려면 여러 이미지 분석 소프트웨어 프로그램 중 하나를 사용하십시오. 강도 광퇴색 보정(intensity bleach correction) 및 gag puncta의 자동 및 수동 추적을 포함한 이미지 분석의 자세한 내용은 동봉된 서면 프로토콜을 참조하십시오.

혼합 후 10분에서 15분 이내에, HIV gag IGFP를 발현하는 jerk cat 세포가 일차 CD4 양성 T 세포에 부착되는 것을 영상으로 확인할 수 있습니다. 이러한 접합체를 통해 감염된 세포뿐만 아니라 표적 세포 내 gag puncta의 이동을 평가할 수 있습니다. 시냅스 형성 후 30분에서 3시간 이내에, cell tracker로 표지된 표적 세포 내부로 gag IG FP puncta가 이동하는 것을 관찰할 수 있습니다.

지금까지 T세포 간의 HIV 세포 간 전이를 시각화하는 방법을 살펴보았습니다. 이러한 절차를 수행할 때, HIV 발현 세포에 노출된 샘플을 취급하는 경우 모든 생물 안전 2등급 플러스(BSL-2+) 또는 생물 안전 3등급(BSL-3) 예방 조치를 준수하는 것이 매우 중요합니다. 또한, 형질전환을 최적화하기 위해 잘 유지된 JCA 세포와 엔도톡신 제거 DNA를 사용하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.