Name: 급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-04T17:32:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: 학습하세요 젠타마이신 정맥 마이크로인젝션을 이용한 제브라피시 급성 신장 상해 모델 구축 방법을. 면역조직화학을 통해 손상된 신세관을 시각화하고 세포 극성 상실 및 세관 구조 파괴를 관찰할 수 있습니다.

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이 작품은 건강 (NIH) 기금 R01DK069403과 P30DK079307 미국 국립 연구소에 의해 투자되었다.

다음과 같은 프로토콜의 일부로 (Hentschel 외. 2005 년)과 (웨인 스테인 외. 1995) 약간의 수정을보고 게시 방법에 따라 달라집니다. 1 부 : Microinjections microinjection을 위해 사전에 설정 <ul><li> 물고기는 이일 후 수정 (DPF)에 주입하고 있습니다. 따라서, 성인 zebrafish는 계획된 실험을하기 전에 3 박 자란 있습니다. 배아를 수집하고 28.5에서 E3 물 (5mM NaCl, KCL 0.17mM, 0.33mM CaCl 2, 0.33mM MgSO 4) 페트리 접시에 넣어 ° C. 페트리 접시 당 80-100 배아가되도록 첫날의 끝에 페트리 접시와 별도의 배아에서 죽은 태아를 제거합니다. </li><li> 전극 풀러와 모세관 튜브 (길이, 0.63 / 0.20 OD / ID 밀리미터 (㎜) R - 6 사용자 정의 유리 튜브 드루먼드 과학 회사, Broomall, PA 9-000-3000 4 인치)에서 당기 유리 바늘을 준비합니다. 팁 직경 10-20 μm의해야한다. 해부 현미경 (Leica S6E), 영구 마커와 통치자의 도움으로, 바늘을 따라 약 10 1mm 라인을 그리기, 그리고 점토 경사로에 큰 페트리 접시에 바늘을 저장합니다. </li><li> 의 내부 직경까지 알콜 램프의 불꽃에 얇은 벽으로 둘러싸인 borosilicate 유리 모세관 (152mm, 1 / 0.75 OD / ID mm TW100 - 6, 세계 정밀 계측기, 주식 회사)의 화재 - 폴란드어 팁 : 들고 피펫 준비 팁은 0.4-0.5 mm이다. 이러한 차원은 2 DPF의 zebrafish의 애벌레의 난황을 잘 파악을 허용합니다. , 유리 조각 긴 집게를 사용하여 모세관과 알콜 램프와 모세관의 반대로 팁을 가열, 1-2 초 동안 불꽃의 하늘색 안쪽 원추, 가장 인기있는 부분을 통해 수직으로 그것을 배치의 한쪽 끝을 잡고 도 녹기 얻기 위해 그것을 압연. 무대 마이크로 미터 (워드 94 W 9910)에서, 몇 번 그런 다음 현미경으로 모세관을 검토이 과정을 반복합니다. 당신이 유충을 처리하는 동안 이것은 중요한 단계는, 몇 지주 pipettes를 해고 - 폴란드어 나중에 적절한 크기를 선택하는 데 필요한 수 있습니다. 당신이주의하는 경우, 하나 들고 피펫 여러 microinjection 세션 지속. </li><li> 제조 업체에서 제공된 지침에 따라 광유와 수동 Microsyringe 펌프 (MMP, 세계 정밀 계측기, 주식 회사), 작성하십시오. 피펫 홀더는 철판 (Narishige, IP)에 자석 스탠드 (Narishige, MN 151)와 연결된 조이스틱 조작하는 사람 (Narishige, MN - 151)에 삽입됩니다. </li></ul> Microinjection <ul><li> 사출 혼합물의 20μl 준비 :. 2.4μl gentamicin (생리 식염수에 시그마 - 알드리치 G8648, 50mg/ml)와 17.6μl 10 KDA 루시퍼 노란색 dextran (Invitrogen D1825을 (생리 식염수에 1mg/ml) 제어 생선에서 gentamicin은 생리 식염수로 대체됩니다. 형광 dextran (여러 색상 사용될 수)가 분사의 정확성을 확인하고 nephrotoxicant로 주입되었을 애벌레를 선택하는 충분하다. </li><li> 솔루션의 증발을 방지하기 위해, 아래에있는 분사 혼합 및 제어 혼합 배치에 대한 2ml 광유 2 30mm 페트리 요리를 준비합니다. </li><li> 400 밀리그램 tricaine 분말 (에틸 - m - aminobenzoate methanesulfonate 시그마 A - 5040) 97.7 ML DD 물, 2.1 ML 1M 트리스 (산도 9) : 마취를 준비합니다. 산도 7 조정할 수 있습니다. 4.2 ML의 aliquots에 냉동실에이 주식 솔루션을 저장합니다. 마취 100 ML의 E3 물 (웨스 1993)에서 4.2 ML tricaine 주식 솔루션을 희석하여 실온에서 떠나 tricaine를 사용할 수 있습니다. </li></ul> 다음 단계는 해부 현미경으로 수행됩니다 <ul><li> 수동으로 미세 집게로 남아있는 모든 chorions를 제거하고 tricaine있는 페트리 접시에서 그들을 전송 zebrafish는 실온에서 예열 마취. Zebrafish는 적어도 15 분 microinjections를 시작하기 전에 tricaine에 노출되어야합니다. </li><li> 면도날 (VWR 과학 55411-050)를 사용하여 주입 바늘의 끝부분을 엽니다. 베벨을 만들고 약 10 - 20μm 직경의 팁 오프닝을 얻기 위해 같은 팁을 잘라 약간 각도에서 칼날을 잡고. </li><li> 전원, 진공 및 microinjection 장치 (세계 정밀 계기 주식 회사, PV820 공압 picopump)의 공기 공급을 켜십시오. micromanipulator 및 틸팅 자료 (워드 정밀 계측기, 주식 회사, 모델 M3301R, TB - 1)에 장착된 바늘 홀더에 바늘을 삽입합니다. </li><li> 바늘을 채우기 위해, 미네랄 오일 (피셔 화학 물질, 0121-1)로 가득 30mm 페트리 접시에 주입하는 솔루션의 비말 (10μl)를 놓으십시오. , 잠수함 솔루션의 드롭 바늘의 팁을을 줄 수있는만큼 매뉴얼 micromanipulator 돌려 picopump을 설정 ( "환기"PV820에 진공을 equates) "환기"로 전환하고, 당겨 바늘을 채우기 "환기 / 개최" 바늘 끝 통해 솔루션입니다. 솔루션을 너무 빨리 바늘에 합격하면 이것은, 몇 분 정도 걸릴 것입니다그것은 팁의 직경이 너무 큰 것을 의미하고, 주사가 정확하지 않습니다. 바늘이 채워진 후 ( "대기"는 PV820에 삽입하는 equates) "대기"로 picopump가 설정할 수 있습니다. </li><li> 바늘을 보정하려면, "문이"마킹 하나에서 다음 (1 여행 초승달 모양 것이 걸리는 시간 (초)을 바늘을 배출하기 위해 발 페달을 눌러 기록 picopump "게이 티드 / 시간이 초과되었습니다"스위치를 설정 mm 총 거리). 3 회 반복 평균 시간 (초)을 받아, 및 솔루션 1 NL을 제공하는 데 필요한 시간 (밀리초)의 수를 결정하기 위해 30 일 (1mm 선형 거리에 해당하는 nanoliters의 볼륨 (NL))의 가치를 나눕니다. 이 번호로 범위 기간 노브를 조정하고, '초과'로 "시간 초과 / 게이 티드"스위치를 이동합니다. 이제 picopump는 솔루션의 1nl 펄스를 제공하기 위해 설정됩니다. </li><li> 미네랄 오일 요리와 위치 현미경으로 애벌레와 페트리 접시를 제거합니다. 그룹 페트리 접시와 초점의 중심에있는 물고기. </li><li> 페트리 접시하기 위해 팁을을 향상시키고 현미경의 초점 비행기로, microinjector의 반대편에있는 매뉴얼 microsyringe 펌프에서 개최 피펫 (MMP, 세계 정밀 기기) 장소. 개최 피펫의 가장 끝은 페트리 접시의 바닥을 감동과 수평에 가까운이다 있도록 비교적 얕은 각도로 구부 러. 응답 시간을 느리게하고 MMP의 정밀도를 감소하는 것이, 시스템에 공기 방울을하지 않도록하십시오. </li><li> 현미경을 높은 배율로 변경하여 개최 피펫 매우 가까운 노른자와 애벌레 생선 등의 측면을 위치로 처리 (테드 펠라 113)와 극상의의 속눈썹을 사용합니다. 수동 microsyringe 펌프를 제어하는​​ 마이크로 드라이브를 반시계 방향 회전으로 ​​잡고 피펫에 노른자를 빠는하여 애벌레 물고기를 잡아. 보관 피펫에 너무 깊이 가져온 경우에는 노른자가 버스트 수있는, 너무 멀리 마이크로 미터를 돌려 안됩니다. 노른자를 통해, 그냥 periderm 아래 위치해 있으며, 매우 높은 혈액 흐름의 사이트입니다 형성 일반 추기경 정맥에 중점을두고 있습니다. 사출 장치의 micromanipulator으로 개발 일반 추기경 정맥에 바늘을 안내입니다. 일반 추기경 정맥은 매우 피상적​​이므로 그것은 일반적으로 삽입 후 다시 조금 바늘을 뽑아 필요합니다. 발 페달을 눌러 솔루션의 1nl를 삽입 후 보관 피펫의 유충을 해제하고 배아 물로 돌아갑니다. 그것은 물고기를 위치하고 흡입 및 장비의 압력을 조절하는 연습의 일정 금액을 필요로하기 때문에, 특히 중요한 단계, 첫 번째 시간입니다. 배아의 노른자가 제대로 잡고 피펫과 함께 개최되는 경우 바늘이 들어오면 그걸로 롤되지 않습니다. </li><li> microinjection의 성공을 확인하려면, 형광 현미경 zebrafish의 중심부에 루시퍼 노란색 dextran의 존재를 모니터링합니다. nephrotoxic 솔루션은 거의 루시퍼 노란색 dextran은 주사의 사이트에 남아 볼 수 사출 2 시간 이내에 정확하게 주입하는 경우 루시퍼의 노란색은 순환 시스템에 dissipating 전에 약 20 분 동안의 심장에 표시 남아 있습니다. 솔루션 난황으로서, 루시퍼 노란색 dextran의 자리에 주입하는 경우 주사의 사이트에 남아있게됩니다. (그림 1). E3 중간에 물고기를 반환합니다. </li><li> 이틀 후 주사, 애벌레 감소 신장 기능의 결과 (그림 2) pericardial 부종을 개발합니다. </li></ul> 2 부 : NA로 고정하고 immunofluorescence + / K + ATPase 항체 (α - 6F) <ul><li> 4 DPF에서 10 4ml 유리 튜브에서 15 애벌레 zebrafish (Weathon, 225,012) 사이에 넣고 1ml 덴트의 (80% MeOH 20% DMSO) RT 4 시간에서 그들을 채운다. </li><li> 솔루션을 pipetting하고 (같은 유리병에 새로운 솔루션을 추가, 등급 MeOH / PBT (0.5 % Tween20와 PBS) 시리즈, 75:25 50:50, 25:75, 100 % PBT에서 배아를 Rehydrate 당 솔루션 1ml 유리병), 각 용액에 20 분. 애벌레가 공기에 노출되지 않을 것입니다, 솔루션을 변경할 때 애벌레를 덮고 조금 솔루션을 두십시오. </li><li> PBT를 제거하고 ° C nutator 4에서 3 시간 동안 차단 솔루션 (PBS 1퍼센트 DMSO와 0.5 % Tween20 10 % 정상 염소 혈청)에 1ml 대체합니다. </li><li> 2ml microfuge에 애벌레를 전송합니다. 혈청 차단 제거하고 nutator 4 ° C에서 하룻밤 (PBS로 1퍼센트 DMSO, 0.5 % Tween20, 2% 정상 염소 혈청) 배양 용액에 300μl 일차 항체로 바꿉니다. 우리는 1시 25분 희석에서 단클론 나 + / K + ATPase의 항체를 (α - 6F, 뜨는, 발달 연구 브리 도마 은행, 아이오와)을 사용 </li><li> 기본 항체를 제거하고 RT에서 부화 솔루션 3 X 30 분 씻으십시오. </li><li> 이차 항체 (염소 안티 - 마우스 cy3, 잭슨 Immunoresearch 연구소 (주) 155-165-003)로 품어은 2 시간에 대한 배양 용액에 1:500 희석RT. </li><li> PBT 3 X 30 분 씻으십시오. </li></ul> 파트 3 : JB - 4 플라스틱 삽입 <ul><li> 단계마다 10 분 등급 에탄올 시리즈 (; 75%,, 95% 백퍼센트 X 2 50 %)을 통해 조직을 탈수. </li><li> JB - 4 임베딩 솔루션 25 ML (Polysciences 0226A)와 촉매 0.24g (Polysciences 02618) : 침투 솔루션을 준비합니다. 촉매가 20-30분 약 분해하는 것은 잠시 걸립니다. 솔루션은 4 저장할 수 있습니다 ° C 최대 1 개월. </li><li> 100 % 에탄올을 가만히 따르다 및 플라스틱 침투 솔루션으로 대체합니다. 회전에 유리병에게 4 ° C를 삽입하고 침투가 유리관의 하단에 애벌레 싱크까지 진행할 수 있습니다. 이 과정은 일반적으로 약 30 분이 소요됩니다. </li><li> 해부 현미경 플레이스 플라스틱 성형 컵 트레이 (Polysciences 주식 회사 16643A) : 프로토콜을 포함. 컵에 충당하기 위해 침투 솔루션과 함께 애벌레를 전송합니다. 플라스틱 퍼가기 미디어는 작은 플라스틱 튜브에 준비가되어 있습니다. 우리는 일반적으로, 한 번에 각각의 컵 하나의 물고기를 4-5 물고기를 포함. 침투 솔루션의 각 ML에 대한 JB - 4 임베딩 솔루션 "B"35 μl (Polysciences 주식 0226B)를 추가 퍼가기 플라스틱 5-6 ML (각 컵에 대한 솔루션을 포함 1.2 ML)를 준비합니다. 침투 솔루션의 각 ML에 대한 JB - 4 임베딩 솔루션 "B"(Polysciences 주식 0226B) 35 μl를 추가합니다. 플라스틱 파스퇴르 피펫 여러 시대와 위아래로 pipetting, 잘 섞는다. 혼합되지 않을 경우 잘 JB - 4가 제대로 중합되지 않으므로이 중요합니다. 퍼가기 플라스틱의 5ml가 준비되고 나면, 파스퇴르 피펫과 샘플 각국의 침투 플라스틱을 제거합니다. 플라스틱을 삽입와 함께 잔을 채우십시오. 플라스틱은 표본으로 블록 홀더 잘 첨부 파일을 위해, 컵 밖으로 스며 나오게하다해야합니다. zebrafish 신장의 tubules를 감지하기 위해 가로 부분은 최고입니다. 이러한 목적으로, 물고기가 수직 포함되며, 아래로 향합니다. 플라스틱 그들이 자신의 위치에서 이동하지 않는 것이 힘든 정도가 될 때까지 처리 또는 미세 집게로 속눈썹의 도움과 함께 정기적으로, 수직으로 물고기를 위치. 그것은 약 20-30분 걸립니다. 그런 다음, 컵을 통해 EBH - 2 블록 홀더 (Polysciences 주식 15,899)을 넣고 ° C 야간 4 트레이를 두십시오. 완료되면에서 중합, 당신은 얼음 조각처럼 블록 튀어나와 있습니다. </li><li> 여러 애벌레의 대체 퍼가기 프로토콜 : 중간 완료 JB - 4와 금형을 기입하고 그것이 중합 수 있습니다. 15mm 정사각형 금형을 위해 우리는 중간 금형을 채울 700μl의 JB - 4 볼륨을 사용합니다. 다음 사전 polymerized 반 채워진 금형에 경화제와 JB - 4 절어 애벌레를 추가합니다. 동양 머리가​​ 금형의 긴 쪽 방향으로 지목하고 애벌레를 정렬과 애벌레 눈알 라인 접속 (당신이 라인에 하나의 몰드 10 물고기를 넣을 수 있습니다) 그럼. 블록 polymerized 후 당신은 블록 가장자리를 잘라 수있는 측면이 칼을 마주되게 시스템을 켜고 마이크로톰에 맞는 플라스틱 "척"에 superglue. 이 방법을 사용하면 같은 플라스틱의 중심 블록, 그리고 크로스 섹션에 대한 준비에 애벌레의 큰 숫자를 배치할 수 있습니다. 케어는 각 물고기의 상당 부분이 하나의 섹션에서 찍은되도록 칼로 블록을 orienting주의가 필요하다. 눈을 통해 sectioning 동안이 수행할 수 있습니다 : 즉, 방향 블록은 눈 상당 부분 각 생선을 찍은 수 있도록. 최종 결과는 하나의 현미경 슬라이드에 concomitantly 많은 물고기를 분석할 수있다. </li></ul> 4 부 : Sectioning <ul><li> 마이크로톰의 척 홀더 (우리가 쉔던 피니스 써모 전기 공사 마이크로톰 사용)로 표본을 설정 </li><li> 45 따뜻한 슬라이드를 설정 ° C. </li><li> 비이커에 DI의 물을 붓고하고 마이크로톰 가까운 곳 </li><li> sectioning 전에 블록이 물고기의 완벽한 가로 섹션을 얻기 위해 같은 방향으로되어 있는지 확인합니다. 방향 헤드 조절 레버는 칼을에 정확하게 표본 헤드를 위치로 사용 회전 수 있습니다. 물고기의 머리를 통해 두꺼운 부분을 절단 시작합니다. 눈을 통해 sectioning 있지만, 방향 블록 것은 눈의 상당 부분은 각 생선을 찍은 수 있도록. pronephric tubules가 시작할 때 가슴 지느러미는 부분에 표시하면, 그입니다. 이 시점에서, 블록에서 32 사 음 섹션에 대한 했네요. </li><li> 포셉로 섹션을 수집하고 포셉로 물을 대지 않고, 그들이 물을 비커에 떨어뜨려. 그것은 물의 표면을 명중 같은 섹션은 즉시 확장되며, 지금은 슬라이드에 수집할 수 있습니다. 45 ° 각도로 물에 슬라이드를 삽입하고 부분만을 경계를 만지고, 처리와 속눈썹의 도움으로 섹션을 접근한다. </li><li> 완전히 건조까지 따뜻한 슬라이드에 슬라이드를 품어. </li><li> epifluorescent 또는 공촛점 현미경을 사용하여 이미지 섹션. </li></ul> 제 5 부 : 대표 레스ults 제대로 수행하면, 주입된 물고기는 작은 형광 dextran 심장과 순환기 시스템에 표시 (루시퍼 노란색이 경우에는)으로, 그림 1처럼 나타납니다. 주사가 너무 깊은 경우, 주입 물질은 난황에 집중적으로 볼 수있다, 또는 마음 과도한 출혈을 일으키는 구멍 수 있습니다. 지주 피펫가 올바르게 만들어진 경우, 물고기 롤되지 않습니다 또는 주입했을 때 이동이 좀 더 정확하게 주사를하실 수 있습니다. 또한, 응답 시간을 느리게하고 시스템의 정밀도를 감소하는 것이, MMP에 공기 방울을 가지고 있지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. 일반적으로, gentamicin의 nephrotoxicity의 결과로 주입 물고기의 80 %가 pericardial 부종 (그림 2) 개발. 우리는 분명 pericardial 부종을 보여주지만, 심각하게 부종이 발생 물고기가 축 곡률을 검토하기 위해 약간과 pericardial 및 트렁크 부종을 보여주 반면 전혀 다른, phenotypes을 관찰할 수없는 적당한 부종과 함께하는 물고기의 표현형 기반 분류 시스템을 사용합니다. 나에 대한 신장 가느다란 관 항체를 사용하여 + / K + ATPase는 (α - 6F) 우리가 컨트롤 (그림 3)에 비해 손상 tubules에서 세포 극성과 관형 중단의 분명 손실, 가로 섹션에 손상된 tubules를 시각화 수 있습니다. 이 패턴은 여러 가로 섹션을 통해 일관성있는 것입니다. 삽입하는 동안 정확하게 물고기를 위치하는 것이 중요 신장 tubules의 완벽한 가로 섹션을 얻기 위해서입니다. 섹션을 비교하면, 가슴 지느러미와 근위 뒤얽힌 tubules은 해부 학적 마커로 사용됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 콩팥 세포 독소의 microinjection. 일반 추기경 정맥, 흰색 화살표 희미한 표정으로 루시퍼 노란색으로 복합 10kDa dextran의 (A) 성공 분사. (B), 순환 시스템, 빨간색 화살표로 분산되지 않습니다 루시퍼 노란색으로 복합 10kDa dextran의 보증금에 잘못 주사 결과. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Gentamicin - 중재 부종. (A) 컨트롤 애벌레 zebrafish를 주입했다. Gentamicin은 (B) 중간 또는 (C) 심한 부종과 애벌레 zebrafish를 주입했다. 모든 애벌레가 왼쪽으로 앞쪽에 4 개의 DPF에 있으며, 지느러미가있다. 블랙 화살표는 B와 C에 pericardial 부종을 가리킨 <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 아키 immunohistochemistry. 컨트롤에 나 + / K + ATPase 48시간 - 게시 gentamicin 분사 (4 DPF의 애벌레) (A, B)과 gentamicin의 주입 (C, D) 유충에 대한 α - 6F 항체 염색법. A, C는 basolateral 극성 및 D에 가느다란 관 장애, 흰색 화살표의 A와 C. 참고 손실의 오른쪽 tubules의 3 배 디지털 배율은 B.에 비해 20X 확대와 B와 D의입니다

<ol><li>Hentschel, D. M., Park, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li>
<li>Majumdar, A., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+no+isthmus+reveals+a+role+for+pax2.1+in+tubule+differentiation+and+patterning+events+in+the+pronephric+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia.</a> Development. 127 (10), 2089-2098 (2000).</li>
<li>Weinstein, B. M., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gridlock%2C+a+localized+heritable+vascular+patterning+defect+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish.</a> Nat Med. 1 (11), 1143-1147 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University Oregon Press. Oregon. (1993).</li>
</ol>

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이 동영상이 문서에서 우리는 zebrafish 애벌레에서 gentamicin 중재 근위 관형 손상을 작성하여 아키 모델에 정맥 microinjection 기술을 시연했다. pericardial 및 / 또는 총 부종의 형성이 손상 결과, 물의 균형을 조절하는 무능력을 반영. 우리는 또한 세포 극성의 손실 및 손상 신장의 근위 가느다란 관의 파괴를 보여주는 차별화된 신장 tubules을 (Majumdar 외. 2000) 마르크 항체와 immunohistochemistry 실험을 설명했다. 정맥 microinjections은 zebrafish 애벌레의 혈류에 가용성 물질을 전달하기위한 효율적인 방법을 나타냅니다. 이 기술은 물질의 다양한 도입을위한 훌륭한 도구이며, 형광 마커 유니폼 주사의 도움과 일치 결과에 대한 허용을 통해 여러 번 반복 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;6F 마우스 단클론 항체</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>블록 홀더 EBH-2</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-6</td><td></td></tr><tr><td>모세관 튜브 R-6 커스텀 유리 튜빙</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3000</td><td></td></tr><tr><td>촉매 분말</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618</td><td></td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>155-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 10k Lucifer yellow, lysine 고정 가능</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>속눈썹</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8648</td><td></td></tr><tr><td>유리 바이알 4ml</td><td>Weathon</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>철판</td><td>Narishige International</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 임베딩 용액 A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 임베딩 용액 B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B</td><td></td></tr><tr><td>조이스틱 마이크로매니퓰레이터</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>자기 스탠드</td><td>Narishige International</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>수동 마이크로시린지 펌프</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세주입 장치</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Shandon Finesse</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일, 라이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>0121-1</td><td></td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 몰딩 컵 트레이</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16643A</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 워머</td><td>Labline Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스테이지 마이크로미터</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>틸팅 베이스</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TB 1</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine 분말</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td>해부 현미경</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td>형광 현미경</td></tr></tbody></table>

급성 신장 상해를 공부하기 위해 zebrafish 애벌레의 정맥 microinjections

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

이 비디오를 문서에서 우리는 nephrotoxicant로 gentamicin을 사용하여 아키의 zebrafish 모델을 설명합니다. 이 기술은 2 DPF의 zebrafish에있는 정맥 microinjections로 구성되어 있습니다. 이 기술은 시간당 15-20 물고기의 주입을 허용, zebrafish 애벌레의 혈류로 수용성 물질을 제공하는 효율적이고 빠른 방법을 나타냅니다. 아키 연구 이외에,이 microinjection 기술은 또한 혈관 조영술과 같은 실험 연구의 다른 유형에 사용할 수 있습니다. 우리는 감소 신장 기능의 시각 대책에 필요한 설비의 기술에 대한 자세한 절차를 제공합니다. 또한, 우리는 또한 신장 가느다란 관 마커, 플라스틱 포함하고 애벌레 zebrafish의 sectioning로 고정, 전체 탑재 immunohistochemistry의 과정을 보여줍니다. 부종, 근위 관 상피 세포에서 세포 극성의 손실, 그리고 가느다란 관의 형태학의 장애 : 우리는 gentamicin와 함께 주입 zebrafish의 애벌레가 일관성이 아키와 형태학의 기능을 보여 보여줍니다.

우리는 이일 이후 fetilization (DPF) 급성 신장 손상 (아키)를 유도하기 위해 zebrafish의 유충에 aminoglycoside, gentamicin을 microinjecting의 기술을 설명합니다. 우리는 또한 전체 탑재 immunohistochemistry하는 방법을 설명, 플라스틱 포함하고 아키 인한 손상을 시각화하기 위해 zebrafish 애벌레의 sectioning.

급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

본 비디오 논문에서는 신독성 물질인 젠타마이신(gentamicin)을 이용한 제브라피시 급성 신손상(AKI) 모델에 대해 설명합니다. 해당 기술은 정맥 내 미세주입...

본 절차의 전반적인 목표는 신독성 물질인 AMG 글리코사이드 Gentamicin을 사용하여 제브라피쉬의 급성 신손상 모델을 구축하는 것입니다. 이는 먼저 수정 후 2일 된 제브라피쉬 치어의 총심장정맥에 gentamicin을 주입함으로써 수행됩니다. 본 절차의 두 번째 단계는 수정 후 4일 된 주입 치어에서 emus 표현형의 점수를 측정하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 수정 후 4일 된 제브라피쉬를 신세뇨관 상피 am 항체를 사용하여 면역조직화학 염색으로 처리하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 제브라피쉬 유충을 절편화하여 세포 극성 상실 및 세뇨관 구조 파괴로 인한 손상된 세뇨관을 시각화하는 것입니다. 최종적으로, 신장 상피 항체를 이용한 면역조직화학 염색을 통해 손상된 신세뇨관 분절을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 저는 피츠버그 대학교 발생생물학과 Neil Hari 연구실의 Carala San Cosentino입니다. 오늘은 수정 후 2일 된 제브라피쉬 유생에 아미노글리코사이드 계열 항생제인 Gentamycin을 미세 주입하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 제브라피쉬 유생에서 급성 신손상을 유도하기 위해 이 절차를 사용합니다.이제 시작하겠습니다. 계획된 실험 3일 전 밤에 성체 제브라피시를 교배시키는 것으로 시작하십시오. 수정 후 2일 된 배아의 단계를 설정하려면 5 mM 염화나트륨, 0.17 mM 염화칼륨, 0.33 mM 염화칼슘, 0.33 mM 황산마그네슘을 사용하여 E3 배지를 준비하십시오. 배아를 수집하여 28.5 °C의 인큐베이터 내에 따뜻한 E3 배수가 담긴 페트리 접시에 넣으십시오.첫째 날 마지막에 페트리 접시에서 죽은 배아를 모두 제거하십시오. 배아를 페트리 접시당 80~100개씩 분리하십시오. 전극 풀러(electrode puller)를 사용하여 모세관을 당겨 최종 직경이 약 10~20 µm가 되도록 유리 주입 바늘을 제작하십시오.풀링 작업 후, 모세관을 해부 현미경 아래에 놓고 자를 사용하여 바늘을 따라 약 1mm 간격으로 10개의 선을 유성 마커로 표시합니다. 바늘은 클레이 램프가 놓인 커다란 페트리 접시에 보관하십시오. 다음으로, 화염을 이용하여 홀딩 피펫을 준비합니다.박벽 붕규산 유리 모세관의 끝부분 연마하기. 긴 집게를 사용하여 유리 모세관을 잡고, 모세관 끝을 화염의 연한 파란색 내부 원뿔 부분에 수직으로 1~2초 동안 놓아 가열합니다. 모세관을 굴려 균일하게 녹도록 합니다.이 과정을 몇 번 반복한 후, 스테이지 마이크로미터를 사용하여 모세관을 검사합니다. 모세관의 직경은 0.4~0.5 mm여야 합니다. 모세관과 홀더가 준비되면, 제조사의 지침에 따라 수동 마이크로 시린지 펌프에 미네랄 오일을 채웁니다.철판에 자성 스탠드로 연결된 조이스틱 매니퓰레이터에 피펫 홀더를 삽입합니다. 신독성 물질 주입 혼합물 20 µL를 준비합니다. 대조군 rva의 경우 Gentamicin 2.4 nL와 Lucifer yellow dextran 17.6 nL를 준비합니다.젠타마이신을 식염수로 교체합니다. 주입 현미경 근처에 2 mL의 미네랄 오일이 담긴 30 mm 페트리 접시 2개를 준비하여 주입 전 신독성 혼합물과 대조군 혼합물을 떨어뜨릴 수 있도록 합니다. 400 mg의 trica 분말을 97.7 mL의 이중 증류수와 2.1 mL의 1 M triss에 녹인 후 pH 7로 조정하여 마취제를 준비합니다.이 스톡 용액 4.2 milliliters를 냉동고에 보관하십시오. trica를 마취제로 사용하려면, 4.2 milliliter의 trica 스톡 용액을 100 milliliters의 E three에 희석하고 실온에 두십시오. 해부 현미경 하에서 주사할 유충을 준비하기 위해, 미세 핀셋을 사용하여 난막(chorions)을 수동으로 제거하십시오. 실온으로 데운 trica가 담긴 페트리 접시에 제브라피쉬 유충을 옮겨 마취시키십시오.제브라피쉬 유생을 trica에 최소 15분 동안 노출시켜야 합니다. 미세 주입을 시작하기 전에 면도날을 사용하여 주입 바늘의 끝을 엽니다. 날을 약간 기울여 베벨(bevel)을 형성하고, 끝부분의 개구 직경이 약 10~20 µm가 되도록 절단합니다.미세주입 장치의 전원과 공기 공급 장치를 켭니다. 니들 홀더에 니들을 삽입합니다. 오일이 채워진 페트리 접시에 주입 용액 10 µL 방울을 떨어뜨려 니들을 채웁니다.현미경 하에서 수동 피코 펌프(pico pump)를 켜고 바늘 끝을 서브 버지(sub burge)합니다. 액적 내에서 피코 펌프를 벤트(vent) 상태로 설정하여 바늘을 채웁니다. 이 과정은 몇 분 정도 소요됩니다.용액이 바늘 안으로 너무 빠르게 이동한다면 팁의 직경이 너무 큰 것이며, 이 경우 주입의 정확도가 떨어지게 됩니다. 바늘이 채워지면, 바늘을 보정하기 위해 pico pump를 hold로 설정한 다음, pico pump 스위치를 gated로 설정하십시오. 풋 페달을 눌러 바늘의 용액을 배출시키고, 메니스커스가 1mm 표시선에서 다음 표시선까지 이동하는 데 걸리는 시간을 초 단위로 기록하십시오. 이 과정을 3회 반복하고 평균 시간을 30으로 나누십시오(여기서 30은 1mm 선형 거리에 해당하는 nL 단위의 부피입니다). 이를 통해 용액 1nL를 주입하는 데 필요한 밀리초(ms) 값을 구하십시오.범위 기간 노브를 이 숫자로 조정하고 게이트 시간 스위치를 timed로 이동합니다. 이제 펄스 펌프가 1 nL의 용액 펄스를 전달하도록 설정되었습니다. 다음으로 유충이 담긴 페트리 접시를 현미경 아래에 배치합니다.유충들을 페트리 접시 중앙으로 모으고 현미경 초점을 맞춥니다. 마이크로 인젝터 반대편에 있는 수동 마이크로 시린지 펌프에 홀딩 피펫을 장착하고, 피펫 팁을 페트리 접시의 현미경 초점 평면까지 전진시킵니다. 홀딩 피펫의 끝부분이 페트리 접시 바닥에 닿으면서 거의 수평이 되도록 상당히 완만한 각도로 구부립니다.현미경의 배율을 더 높게 변경하고 손잡이가 달린 초미세 속눈썹 붓을 사용하십시오. 제브라피시 치어의 등쪽이 아래로 향하게 하고 난황이 홀딩 피펫에 매우 가깝게 위치하도록 조정합니다. 수동 마이크로 시린지 펌프를 제어하는 마이크로미터 드라이브를 시계 반대 방향으로 돌려, 난황을 홀딩 피펫 속으로 흡입함으로써 제브라피시 치어를 고정합니다.난황이 터질 수 있으므로 마이크로미터를 너무 많이 돌리지 않도록 주의하십시오. 홀딩 피펫 안으로 너무 깊게 당겨진 경우에는, 난황 바로 위 외피(periderm) 아래에 위치하며 혈류량이 많은 공통 추체정맥(common cardinal vein)이 형성되는 지점에 초점을 맞추십시오. 주입 장치의 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 수행합니다.바늘을 발달 중인 총심장정맥(common cardinal vein)으로 안내하십시오. 총심장정맥은 매우 표면에 위치하므로, 삽입 후 바늘을 약간 뒤로 빼는 것이 일반적으로 필요합니다. 홀딩 피펫으로 유충의 요크(yoke)를 적절히 고정했다면, 바늘이 들어갈 때 유충이 구르지 않을 것입니다.풋 페달을 눌러 1 nL의 용액을 주입합니다. 그런 다음 홀딩 피펫에서 유충을 분리하여 유충 배양수로 되돌립니다. 미세주입의 성공 여부를 확인하려면 제브라피쉬 유충의 심장에 Lucifer yellow dextran이 존재하는지 모니터링하십시오.형광 현미경 하에서 Lucifer yellow는 순환계 내에서 약 20분 동안 관찰 가능하며, 수정 후 4일 된 유어를 신선한 E3 배지로 옮깁니다. 4 mL 유리 바이알에 제브라피쉬 유어를 10~15마리씩 넣고, 실온에서 1 mL의 dents로 4시간 동안 고정합니다. 0.5% PBS가 포함된 단계별 메탄올 시리즈(25% to 75%, 50% to 50%, 25% to 75%, 100% PBS)를 사용하여 유어를 재수화하며, 이때 기존 용액을 피펫으로 제거하고 동일한 바이알에 새 용액을 추가합니다.바이알당 1 mL의 용액을 넣습니다. 각 용액에서 20분 동안 처리합니다. 유충이 공기에 노출되지 않도록 주의하십시오.항상 유충이 충분히 잠기도록 소량의 용액을 남겨 두십시오. 용액을 교체할 때, PBT를 제거하고 1% DMSO와 10% normal goat serum이 포함된 blocking solution PBS 1 mL로 교체한 후, mutator에서 4°C로 3시간 동안 반응시킵니다. 이후 유충을 2 mL eph로 옮깁니다.블로킹 혈청을 제거하고 1:25로 희석한 monoclonal sodium potassium at TPS alpha six F supernat 1차 항체 300 µL와 1% DMSO, 0.5% tween 22%, normal goat serum 2%가 포함된 PBS 배양액 300 µL를 추가합니다. 이후 4 °C의 쉐이커에서 하룻밤 동안 배양합니다. 1차 항체를 제거하고, 상온에서 1 mL의 배양액으로 30분씩 3회 세척하며, 각 세척 단계마다 쉐이커 위에 둡니다.그런 다음 배양액에 1:500로 희석한 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 이후 PBT로 30분씩 3회 세척하고, 단계별로 10분씩 침지하는 단계별 에탄올 시리즈를 통해 유충을 탈수합니다. JB-4 매몰액 A 25 mL와 촉매 0.24 g을 사용하여 20~30분 동안 용해시켜 침투액을 준비합니다. 이 용액은 4 °C에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다.100% ethanol을 제거하고 플라스틱 침투액으로 교체합니다. 튜브를 4°C의 로테이터(rotator)에 놓고 유충이 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 약 30분 동안 침투시킵니다. 유충을 포매하기 위해 플라스틱 몰딩 컵 트레이를 해부 현미경 아래에 배치합니다.유충이 충분히 잠길 정도의 침투액과 함께 유충을 컵으로 옮깁니다. 플라스틱 포매제는 작은 플라스틱 튜브에 준비합니다. 일반적으로 한 번에 4~5마리의 유충을 처리하며, 컵당 유충 한 마리를 사용하고 5 mL의 포매용 플라스틱을 준비합니다.침투 용액 1 mL당 JB-4 매몰 용액 B 35 µL를 첨가합니다. JB-4가 적절하게 중합될 수 있도록 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 여러 번 상하로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 매몰용 플라스틱 5 mL가 준비되면, 라운드 샘플에서 침투용 플라스틱을 파스퇴르 피펫으로 제거합니다. 컵을 매몰용 플라스틱으로 채우며, 블록 홀더가 시료에 잘 부착되도록 플라스틱이 컵 밖으로 흘러나와야 합니다.제브라피시의 신세뇨관을 검출하기 위해서는 횡단면이 가장 적합합니다. 유어는 수직으로 매립해야 합니다. 손잡이가 달린 속눈썹 핀셋이나 미세 핀셋을 사용하여 머리가 아래로 향하게 하십시오.플라스틱이 충분히 단단해져 유충이 위치를 벗어나지 않을 때까지 주기적으로 유충을 수직으로 세워 줍니다. 이 과정은 약 20분에서 30분 정도 소요됩니다. 그 다음 컵 위에 EVH 2블록 홀더를 얹고 트레이를 4°C에서 하룻밤 동안 보관하여 중합 반응이 완료되도록 합니다.시료를 마이크로톰의 척 홀더에 고정하고 슬라이드 워머를 45 °C로 설정하십시오. 탈이온수를 비커에 부어 섹셔닝 전에 마이크로톰 가까이에 배치하십시오. 유충의 완벽한 횡단면을 얻을 수 있도록 블록의 방향을 설정해야 합니다.방향 조절 헤드 레버를 회전시켜 시료의 위치를 잡고 백라이트를 조정합니다. 헤드 부분을 통해 두꺼운 절편을 제작하십시오. 각 유충의 눈 부분에서 동일한 절편이 채취될 수 있도록 블록의 방향을 설정하십시오.단면에서 가슴지느러미가 나타나면, 그때부터 복와세뇨관(prone tubules)이 시작되는 지점입니다. 이 시점부터 블록에서 약 32장의 4 micron 두께 단면 슬라이스를 절단하십시오. 핀셋으로 단면들을 수집하여, 핀셋이 물에 닿지 않도록 주의하며 물이 담긴 비커 속으로 떨어뜨리십시오.절편이 수면에 닿는 즉시 확장됩니다. 이제 슬라이드로 이를 수집할 수 있습니다. 슬라이드를 45도 각도로 물에 넣고, 손잡이가 달린 속눈썹 붓으로 절편의 가장자리만 살짝 건드려 접근하여 수집하십시오. 슬라이드를 슬라이드 워머에서 완전히 건조될 때까지 배양한 후, 에피 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 절편을 촬영하십시오.올바르게 수행되었을 때, 주입된 유충은 위쪽 이미지에서 보는 바와 같이 유충의 혈관계에 형광 루시페라제 yellow dextran이 나타납니다. 아래쪽 이미지와 같이 주입이 너무 깊게 되면, 주입된 물질이 난황낭에서 관찰되거나 심장이 천공되어 과도한 출혈이 발생할 수 있습니다. 여기에서 보는 바와 같이, gentamicin 신독성의 결과로 유충에 심낭 부종이 발생했습니다.상단의 대조군 유충들은 심낭 부종을 보이지 않습니다. 반면, gentamycin을 주입했을 때 제브라피시 유충의 80%가 중간 및 하단 패널의 화살표로 표시된 것과 같이 중등도 또는 중증의 부종을 나타냅니다. 당사는 중등도 부종이 있는 유충이 뚜렷한 심낭 부종을 보이지만 그 외 다른 관찰 가능한 표현형은 나타내지 않는 표현형 기반 분류 시스템을 사용합니다.sodium potassium atpa ace에 대한 신세관 항체를 사용했을 때, 심한 부종을 보인 유충은 심낭 및 몸통 부종, 몸통 순환 결핍, 그리고 경미하거나 중간 정도의 축 굴곡을 나타냅니다. 손상된 세관은 횡단면에서 시각화되며, 패널 A와 B의 대조군과 비교하여 패널 C와 D에서는 뚜렷한 세포 극성 상실과 손상된 세관의 관 구조 붕괴가 관찰됩니다. 이러한 패턴은 여러 횡단면을 비교했을 때 일관되게 나타납니다. 해부학적 표지자로 Factorial fins와 근위 세뇨관이 사용되었습니다.지금까지 제브라피쉬 치어에서 급성 신손상을 유도하는 방법을 살펴보았습니다. 이 절차를 수행할 때는 직경이 10-20 µm인 주사 바늘을 사용하는 것이 중요합니다. 적절한 크기를 얻기 위해 몇 개의 홀딩 피펫을 파이어 폴리싱(fire polish)해야 할 수도 있으나, 일단 적절한 크기가 확보되면 여러 차례의 주사 세션 동안 계속 사용할 수 있습니다.또한, 마이크로 시리즈 JA 장치 내에 기포가 없도록 확인하는 것이 중요한데, 이는 시스템의 정밀도를 저하시킬 수 있기 때문입니다. 마지막으로, 신세뇨관의 완벽한 횡단면을 얻기 위해 포매 과정 동안 물고기를 수직으로 배치하십시오. 이것으로 모든 과정이 완료되었습니다.시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

인간의 급성 신장 상해 (아키)는 신장 nephrons을 구성하는 상피 세포 손상으로 인한 일반적인 임상 문제, 그리고 아키는 50~70% 1 높은 사망률 속도와 연결되어 있습니다. 이 현상을 안내하는 메커니즘과 한계가 제대로 이해 남아 있지만 상피 세포의 파괴에 따라 nephrons은 재생에 제한 기능이 있습니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 타겟 레이저 zebrafish 배아 신장의 신장 nephron 세포의 박리 또는 pronephros위한 기술을 설명합니다. 새로운 방법은 아키의 nephrotoxicity 유도된 모델을 보완하고 신장 nephron의 상피 조직이 재생된과 관련된 세포 및 분자 변경의 고해상도 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부

이 비디오는 신장 기능에 대한 화학적 영향을 연구하기 위해 제브라피시 배아의 꼬리 정맥에 네프로톡신을 정맥 미량 주입하는 방법을 보여줍니다.

제브라피시 배아에 네프로톡신의 정맥 미량 주입: 제브라피시 배아의 혈류로 신독성 물질을 전달하는 기술

제브라 피쉬의 성인 신장은 신장 재생과 질병 연구를위한 훌륭한 시스템입니다. 이러한 연구의 중요한 양태는 네프론의 구조와 기능의 평가이다. 이 프로토콜은 네프론의 세뇨관 조성물을 평가하기 위해 신장 재 흡수를 평가하도록 구현 될 수있는 몇 가지 방법론을 설명한다.

성인 Zebrafish의 신장에서 네프론의 구성 및 기능 분석

여기에서는 겐타마이신 주사로 급성 신장 손상을 유발하여 성인 신장 재생을 연구하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. 우리는 부상이 겐타마이신 투여량과 환경 온도에 따라 달라진다는 것을 보여주며, LHX1a+가 새로운 네프론을 개발하기 위해 현장 교잡법을 사용합니다.

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

화학 요법으로 항생제에 이르기까지 약물을 포함 nephrotoxins에서 발생하는 신장 손상은, 그 발병 기전 불완전하게 이해 남아 복잡한 질환이 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 제브라는 신장 보호 대책의 식별에 적용 할 수있는 이러한 조건의 질병 모델에 사용할 수있는 방법을 보여준다.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

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Zebrafish 개발에 급성 신부전 모델링을위한 정확한 세포 제거 방법

이 문서에서는 빠르고, 최소 침 습으로 주사를 형광 미의 작은 물고기의 circulatory system 및 물고기의 혈액에 미의 비보에 시각화의 원칙을 보여 줍니다.

간단 하 고 효과적인 관리 및 신장 주입을 사용 하 여 작은 물고기의 순환 시스템에 미의 시각화

이 프로토콜은 신장 독성 제로 cisplatin를 사용하여 성인 얼룩말 피시에 급성 신장 상해 (AKI)를 유도하는 절차를 설명합니다. 신장 조직에서 염증및 세포사멸을 분석하기 위한 기술과 2가지 기술의 재현성을 평가하는 단계, 각각 세포측정및 TUNEL을 상세히 설명했다.

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성체 제브라피시에서 새로운 복강내(IP) 주사 방법에 대해 설명합니다. 독소루비신(doxorubicin)과 같은 독성 화합물을 취급할 때 이 절차는 이전에 보고된 두 가지 IP 방법보다 더 효과적입니다. 이 기술은 제브라피시 모델에 대한 경험이 제한된 연구원들이 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었습니다.

성체 제브라피시의 복강 내 주사 기법으로 신체 손상 및 관련 폐사율을 최소화합니다.

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성체 제브라피쉬에 최적화된 정맥 주사

유전적으로 감수성이 있는 유기체에서 염증 신호가 신경 발달에 미치는 영향을 모델링하기 위해, 우리는 제브라피시 유충의 Cuvier관(공중정맥)에 IL-6를 미세주입하는 프로토콜을 제시하여, 결절성 경화증 복합체(TSC) 맥락에서 염증을 통제된 유도하고 발달 영향을 평가할 수 있게 합니다.

신경정신질환과 유사한 행동을 연구하기 위한 TSC 제브라피시 유충 혈류에 인터루킨-6 미세주입

학습하세요 젠타마이신 정맥 마이크로인젝션을 이용한 제브라피시 급성 신장 상해 모델 구축 방법을. 면역조직화학을 통해 손상된 신세관을 시각화하고 세포 극성 상실 및 세관 구조 파괴를 관찰할 수 있습니다.

급성 신장 상해를 공부하기 위해 Zebrafish 애벌레의 정맥 Microinjections

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