Name: 트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 배우세요 C. elegans에서 생물학적 포격법을 이용한 트랜스제닉 웜 생성 방법을. DNA 코팅된 금 입자로 유전자 조절 연구를 위한 효율적인 대안 기술을 익히세요.

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이 작품은 ALF에 피츠버그, NIH 교부금 AG028977 대학에서 씨앗 기금에 의해 지원되었다

개요 전통적으로 유전자 변형 벌레는 C.에 transgene DNA를 microinjecting에 의해 생성되었습니다 엘레간스 germline 1,2,3,4. 성공하는 동안,이 방식은 전문적인 장비와 웜 해부학과 microinjection 기술과 경험의 개발이 필요합니다. 최근 biolistic 폭격은 germline 5,6로 외국의 DNA를 소개하는 DNA - 코팅 금 입자를 사용하는 다른 접근법으로 개발되었습니다. 이러한 접근 방식을 지배할 수 있도록 실천의 관점에서 적은 시간 투자를 필요로합니다. C.의 biolistic 충격 성공 동물의 대량이 필요하므로 유전자 변형 벌레를 생성하는 엘레간스은 개별 웜의 수준 낮은 효율성있다. 이러한 여러 가지 방법으로 성장하지만, 우리는 참여 접시의 작품과 전화 번호를 줄이기 위해 계란 접시를 사용하실 수 있습니다. 우리 프로토콜은 계란 접시 및 웜의 준비로 시작하고 다음 바이오 래드 PDS-1000/He Hepta 시스템을 사용하여 충격 프로토콜에 중점을 둡니다. 우리는 Berezikov 외 7 직장에서 일부의 프로토콜을 적응. 폭격으로 UNC - 119 유전자는 일반적으로 유전자 변형 동물에 대한 표지로 사용됩니다. 이 변이를 가지고 웜 변종이 심각하게 uncoordinated하고 거의 이동 외모 땅딸막한하고 있으며, dauer의 애벌레 8 양식 수 없습니다. dauer은 불리한 조건에서 생식 성인에 개발을 지연하는 데 사용되는 대체 애벌레 단계이며, dauer에 항목이 여러 유전자 ​​9 규제입니다. UNC - 119 유전자를 가지고 몇 가지 계통 C.에서 구할 수 있습니다 엘레간스 유전학 센터 (CGC, 미네 아 폴리스, MN). 원래 DP38 스트레인 (UNC - 119 (ed3)가)도 하류 실험에 영향을 미칠 수있는 관련이없는 dauer - 형성 제정 (DAF - C) 변이를 수행합니다. 여러 실험실이 변이를 outcrossed 있고, HT1593 긴장이 CGC에서 구할 수 있습니다. 우리는 유전자 변형 동물이 다소 DP38 변형들과 자신을 동일시하기 쉽게하고 유전자 변형 동물을 만드는이 변형을 사용하는 경향이 것을 발견했습니다. 필요한 경우, 우리는 DAF - C 변이를 제거하는 유전자 변형 벌레를 outcross하는 HT1593을 사용합니다. transgenes을 준비하는 동안 우리는 성장 접시의 재고를 유지하므로 DP38 벌레가 성장하기 것은 프로토콜에 가장 느린 단계 중 하나입니다. 관심의 유전자와 함께 UNC - 119 마커의 표현이 정상적인 운동성 및 신체 크기 5 구조에 따라 transgene을 표현하는 동물을 쉽게 확인하실 수 있습니다. UNC - 119 유전자는 작은 C. 여러 소스와 벡터 UNC - 119 게놈 DNA를 사용하여 UNC - 119 발기인 및 cDNA, 그리고 게놈 DNA에서 얻을 수 있습니다 briggsiae 유전자는 8,10를 사용하고 있습니다. 우리는 최근 동종 재조합 11 유전자 변형 동물에게 12을 생성하는 Cre 호텔 - 훈제 연어의 재조합에 의해 UNC - 119 유전자를 수행하는 웜 fosmids를 수정하는 방법으로 암피실린 저항 유전자를 포함하는 플라스미드에 UNC - 119 카세트를 추가하는 간단한 프로토콜을 설명했다. plasmids은 Addgene 주식 회사 (캠브리지, MA)에서 사용할 수 있습니다. 하나의 폭격을 수행 관련된 노력이 중요하지만, 관리하는 동안, 하루에 여러 bombardments 수행에 관련된 추가 작업을 최소화합니다. 따라서, 우리는 정기적으로 각 생성에 관련된 작업을 감소하기 위해 유전자 변형 벌레의 생산 클러스터. 1. 에그 플레이트 준비 UNC - 119 돌연변이 웜 때문에 그들은 접시의 다른 부분은 여전히 음식을 포함하는 동안 접시의 부품에 굶어하는 경향들이 장애인 이동성 표준 NGM 접시에 성장 어렵습니다. 계란 접시에 두꺼운 식품 레이어가 UNC - 119 웜보다 쉽게 크롤 링하고 모든 접시 7 대신할 수로 에그 번호판이 문제를 해결. 계란 접시는 또한 적은 접시가 13 필요하므로 벌레 다수의 성장을 지원하는 혜택을했습니다. 보통 5 계란 접시 하나 폭격을 위해 벌레를 성장하기에 충분합니다. 아래의 제조법은 약 50 접시하게하지만, 원하는 경우에는 적은 수 있도록 halved 수 있습니다. 우리가 접시에 항생제와 antifungal 약물 모두를 사용하고 오직 접시 시딩에 대한 차아 염소 산염 처리에 의해 생성된 계란을 사용하므로 계란 접시 쉽게 오염이 될 수 있습니다. 1 일 : <ol><li> 500mL 병 속에 LB (400 ML)를 준비합니다. 20 분 대한 압력솥. </li><li> 2 % 한천과 1리터 팡가를 사용하여 ~ 50 10cm 팡가 번호판을 붓고. 우리는 200 μg / ML 13 리터와 스트렙토 마이신 당 nystatin 10 ML를 추가합니다. </li><li> 200 μg / ML 스트렙토 마이신과 LB에 OP50 - 1의 40 ML 야간 문화를 성장. 이 변형은 스트렙토 마이신 저항과 CGC에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 의 500mL 병 압력솥다음날. </li></ol> 일 2 : <ol><li> 멸균 병에 10 닭고기 계란 별도의 yolks. 우리는 노른자 구분 (대상을 포함한 가정용 매장에서 사용 가능)을 사용합니다. 흔들어. </li><li> LB와 400mL에 볼륨을 가져와. 악수 </li><li> 1 시간 동안 60 ° C에서 알을 품다. </li><li> 실내 온도 쿨. </li><li> OP50 - 1 40mL를 추가합니다. 악수 </li><li> 판 당 혼합물의 5-8 ML를 배포합니다. </li><li> 접시가 하룻밤 실온에서 정착하도록 허용합니다. </li></ol> 3 일 : <ol><li> 부드럽게 접시에 남아있는 액체를 부어. 하룻밤 상온에서에서 뚜껑과 건조하도록 허용합니다. </li></ol> 일 4 : <ol><li> 필요한 ° C까지 4 상자나 비닐 봉지와 가게에 접시를 넣어. 이 번호판은 1-2 개월 동안 사용하도록 확인하는 나타납니다. </li></ol> 2. 에그 플레이트을 심는 <ol><li> 최근에 굶주린 접시에 집중 OP50을 추가하여 6cm 팡가 플레이트에 DP38 벌레를 확장합니다. 하나의 충격에 대해서는 종자 5 계란 접시에 작은 접시 ~ 6을 사용합니다. 여러 bombardments을 위해, 우리는 계란 접시을 심는 전에 대신 씨앗이 풍부한 펩톤 플레이트에있는 작은 접시를 사용합니다. </li><li> 차아 염소 산염 13,14의 사용을 통해 DP38 웜에서 계란을 분리. 무균 S - 기초 또는 M9 버퍼 13,14에 계란을 Resuspend. </li><li> 계란 접시의 해당 번호로 달걀 (플레이트 당&gt; 10,000) 추가합니다. 충격에 사용할 7-10일 20 ° C에서 계란 접시에있는 벌레를 성장. 번호판이 벌레는 접시에서 음식을 취소하고 일단 시작되면 사용할 수 있습니다. 이 번호판은 굶어과 이상에 대한 기간이 증가하면 웜 수율을 개선하는 것입니다 정말 열심히하고 있습니다. </li></ol> 충격 우리는 미리 황금 주식을 준비하고 ° C 사용을위한 4 저장되어 유지. 또한 필요는 얼룩이없는 그리고 10cm 팡가 번호판을 발견하고 있습니다. 얼룩이없는 접시는 사전에 잘 붓고 철저하게 벌레와 함께 추가된 액체의 흡수를 용이하게하기 위해 건조 허용해야합니다. 처음엔 DNA - 코팅 금 입자를 준비 시작 폭격의 날, 우리는 벌레를 씻어. 우리는 다음 얼룩이없는 팡가 플레이트에 벌레를 추가하고 금 입자를 세척하고 macrocarriers에게 전송 완료. 골드 입자 준비 : <ol><li> 1.7mL 튜브에 금 입자의 60mg을 무게와 15에 대한 70 %의 에탄올에 만끽해보세요. 금 입자를 침전하기 위해 간단히 스핀. </li><li> 무균 물에 3 번 세척하고 금괴를 수집하기 위해 간단히 때마다 스핀. </li><li> 50% 무균 글리세롤의 1mL에 금을 Resuspend. 이것은 주식 골드 입자 솔루션이며, 4 개월 동안 저장할 수 있습니다 ° C. </li></ol> 웜 : <ol><li> S - 기초 또는 M9 버퍼와 함께 계란 접시에서 DP38 벌레를 플로트와 50mL 원뿔 관에게 전송할 수 있습니다. </li><li> 웜은 아래에까지 벤치에 튜브를 유지. 다음 버퍼를 대기음 신선한 S - 기초 또는 M9를 추가합니다. 버퍼 조각이 비교적 명확 때까지, 2 또는 3 번 씻으십시오. DNA를 코팅이 완료될 때까지이 단계에서 웜 보관하십시오. </li><li> 기음과 폭격 당 버퍼에 벌레 약 2-3 ML 두십시오. 얼음 10cm 얼룩이없는 팡가 플레이트로 전송. 팡가 플레이트가 충돌하기 전에 완전히 건조해야합니다로 전송 볼륨을 최소화 중요합니다. 벌레와 함께 접시의 전체 표면을 커버해야합니다. </li><li> 접시 얼음 건조하도록 허용합니다. 얼음이 건조하는 동안 clumping에서 벌레를 방지할 수 있습니다. </li></ol> 이 단계는 중요합니다 : 접시는 건조해야하며 벌레가 균일하게 팡가 판에 분산. 얼음 벌레를 유지하면 접시 더미로 이동하고 통합에서 그들을 방지합니다. DNA 준비 (한 충격에 대한) <ol><li> 1.7mL 튜브에 혼합 : <ul><li> 50μl 금 입자. 추가하기 전에 철저히 Resuspend. </li><li> 50μl DNA (10 - 15ug). 우리는 원형 또는 선형의 DNA 사이의 작은 차이를 참조하십시오. 보통 우리는 (Qiagen 주식 회사, 발렌시아, CA) DNA의 정화를 위해 Qiagen midiprep 카트리지를 사용합니다. </li><li> 50μl 2.5M CaCl 2. 이 솔루션은 실온에서 몇 주 동안 안정합니다. </li><li> 20μl 0.1M spermidine. spermidine은 수용액에서 불안정합니다. 우리는 -20 ° C.에 70μl spermidine의 aliquots 및 저장을 우리는 다음 0.1M 솔루션을 얻기 위해 바로 사용하기 전에 물을 1mL 추가할 수 있습니다. 이 솔루션은 각 폭격 신선한 준비하셔야합니다. vortexing하면서 우리는 일반적으로 와동 다음 골드 낮은 속도로 1.7mL 튜브 입자 및 CaCl 2, DNA와 spermidine / 프로타민 dropwise를 추가합니다. 인산 칼슘과 transfected 가지고있는 사람들에게이 기술은 잘됩니다. 우리는 아주 좋은 결과를 15 대신 spermidine의 프로타민에도 사용합니다. 우리는 물 속에 새로운 솔루션 (1mg/mL)를 준비하고 우리가E 50μl 대신 spermidine의 20μl. 우리가 프로타민 사용하는 경우, 우리는 일반적으로 대신 얼음에 넣어 10 분 동안 상온에서 혼합을 품어. 프로타민는 냉동 보관을하지 않아도 및 분말 액체 대신합니다. </li></ul></li><li> 30 분 대한 얼음 혼합물을 품어하고, 주기적으로 정지에서 금 입자를 유지 섞는다. 그렇다면 간단히 회전 및 뜨는을 대기음. </li><li> 300μl 70 % 에탄올로 씻으십시오. 간단히 스핀. </li><li> 1mL 100 % 에탄올로 씻으십시오. 간단히 스핀. </li><li> 170μl 100 % 에탄올에 Resuspend. </li></ol> macrocarriers의 준비 : <ol><li> 2 프로파놀 7 macrocarriers을 (바이오 - 래드 연구소, 헤라클레스, CA) 린스. 조직 종이에 넣고 실온에서 그들을 말리면. </li><li> 각 macrocarrier의 중심에 DNA / 골드 혼합의 20μl를 추가합니다. 정지에있는 금괴를 유지하는 pipetting 전에 와동 오른쪽해야합니다. </li><li> 에탄올이 증발하자. </li></ol> 3. 충격 실험 시스템을 통해 헬륨을 내리려고하기 전에 빈 폭격을 수행할 수 있어야합니다. <ol><li> 진공 펌프와 가까운 진공 펌프 트랩을 켜십시오. 우리는 석유가없는 진공 펌프를 사용합니다. </li><li> 헬륨 탱크를 켜십시오. 그 압력이 2200psi입니다 ≥ 확인하십시오. </li><li> 2 프로파놀에 젖은 파열 디스크가 (1350 PSI), hepta 어댑터에 뚜껑을 유지에 배치. </li><li> PDS - 1000 시스템에 어댑터를 나사와 공급 토크 렌치로 조입니다. </li><li> 홀더 및 좌석 그들 제공된 도구로 7 macrocarriers를 놓습니다. 다음 소유자에 hepta 정지 화면과 바닥을 넣어. 위에서 두 번째 선반에 이상 홀더와 장소를 뒤집기. macrocarriers의 황금 발견 측면이 시점에서 아래로 향하게해야합니다. </li><li> hepta 어댑터의 콘센트와 macrocarrier 홀더의 상단에있는 구멍을 맞춥니다. </li><li> 충격 챔버에서 가장 낮은 선반에 벌레 (덮개 해제)로 코팅 팡가 접시를 놓습니다. </li><li> 완전히 PDS - 1000에 진공 흐름 속도 노브를 엽니다. 챔버는 HG 26에 도달할 때까지 VAC 버튼을 누르십시오. 다음 진공을 유지하기 위해 위치를 고수로 전환합니다. </li><li> 디스크 파열까지 화재 버튼을 누르고 있습니다. 압력이 1350psi에 도달하면 이런 현상이 발생합니다. 때로는 이것이 발생하는 5-20초 걸립니다. 단추를 놓습니다. </li><li> 챔버 (환기 위치)에서 진공을 출시하고, 플레이트를 제거합니다. </li><li> 진공 및 헬륨 꺼. </li><li> 라인 헬륨 (헬륨 게이지가 0 PSI를 표시한다)가 포함되어 있지 않습니다 때까지 여러 번 화재. </li><li> PDS - 1000 시스템을 끄십시오. </li></ol> 충격 후 웜 복구 : <ol><li> ° C 20 분 20 포격 접시를 남겨주세요. </li><li> 10 ML S - 기초 또는 M9 버퍼 접시에서 벌레를 플로트. </li><li> 10cm 발견 팡가 플레이트 - 20 0.5mL 벌레를 넣어. </li><li> 약 2 주 동안 ° C 또는 객실 온도 (22-24 ° C) 구조 벌레에 대한 확인하기 전에 20 둡니다. </li><li> 해부 현미경으로 UNC - 119 (+) 표현형과 벌레에 대한 화면. 구조 웜이 아닌 구조의 웜 이상 생존 이점을 가지고 이후 플레이트가 굶어 죽었 후 심사를위한 최적의 시간입니다. </li><li> 구조 벌레를 포함된 각 10cm 접시에서 한 개인의 라인을 생성합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 유전자 변형 동물을 얻기에 관해서와 프로토콜의 성공은 특정 transgene에 따라 달라집니다. 발기인의 경우 : GFP의 기자 transgenes 우리 20 라인까지 취득했습니다. 보다 일반적인 결과는 3-10 행이다. 최대 형질 라인의 30 %에 통합 라인은 있지만, 이것은 임의이며 통합된 라인이 특히 필요한 경우 우리가 하루에 여러 bombardments을 수행합니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Biolistic 폭격 C. 포함한 많은 생물에 외국의 DNA를 소개하는 간단한 방법입니다 엘레간스 1,5,6,7,16. 그것은 CaCl 2의 면전에서 DNA와 복잡한를 형성 금 입자에 의존하고 있습니다. 같은 spermidine과 같은 양이온 polyamines은 생체내의 nuclease 저하로부터 DNA를 보호합니다. spermidine는 불안 정한 분자이기 때문에, 그것은 -20 ° C에서 작은 aliquots에 저장하고, 바로 폭격을 수행하기 전에 솔루션을 확인하는 것이 중요합니다. 우리가 폭격 프로토콜에 설명한 바와 같이, 프로타민 외국 DNA 15을 제공하는 대신 spermidine의 사용할 수 있습니다. 프로타민은 상온에서보다 안정되고 대신 점성 액체 분말되는 장점이 있습니다. UNC - 119 구조 유전자는 transgene 같은 플라스미드 또는 이전 코팅...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<table><tbody><tr><td>금 입자</td><td>Inbio gold</td><td>BD021</td><td>1micron</td></tr><tr><td>Midiprep 키트</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4139</td><td></td></tr><tr><td>Protamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>매크로캐리어(Macrocarriers)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000/He Hepta 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>파열판(Rupture disk)</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr></tbody></table>

트렌스 제닉의 생성 c. 엘레간스 biolistic 변환에 의해

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

무료 생활 선충류의 C.를 사용하는 실험실의 개수 엘레간스이 급속도로 성장하고있다. 이 생물 학적 모델의 인기는 빠른 세대 시간과 짧은 수명, 간단하고 저렴한 유지 보수, 완전 합성 게놈과 RNAi 자원과 돌연변이 동물의 배열에 따라 결정됩니다. C.의 또한, 분석 엘레간스 게놈은 벌레의 연구는 전체 생쥐이나 교양 세포에서 수행한 연구에 중요한 부가 될 수 있다고 제안 웜 이상의 척추 동물 사이 좋은 유사를 공개했다. 웜 연구의 강력하고 중요한 부분은 유전자 현지화 및 기능을 연구하기 위해 유전자 변형 동물을 사용하는 능력입니다. 유전자 변형 동물 중 웜 germline의 microinjection을 통해 또는 biolistic 폭격의 사용을 통해 만들 수 있습니다. 폭격 새로운 기술이며, 실험실의 숫자로 덜 익숙한 것입니다. 여기서 우리는 바이오 래드 PDS - 1000 시스템을 사용 금 입자와 충돌하여 biolistic 유전자 변형 벌레를 생성하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 남녀 추니 germline로의 DNA microinjection에 비해,이 프로토콜은 웜 해부학을 식별하거나 microinjection을 수행 관련하여 운영자로부터 특별한 기술을 필요로하지 않는 장점이 있습니다. 또한 여러 형질 라인은 일반적으로 하나의 충격에서 얻을 수 있습니다. 또한 microinjection에 대조적으로, biolistic 폭격 extrachromosomal 배열과 통합 transgenes 모두 유전자 변형 동물을 생산하고 있습니다. 통합 형질 라인을 얻을 수있는 능력은 외국 DNA를 통합하는 mutagenic 프로토콜의 사용을 피할 수 있습니다. 결론적으로, biolistic 폭격 특히 microinjection에 숙련되기 위해 필요한 시간과 노력을 투자에 관심이없는 조사에 대해, 유전자 변형 동물의 생성을 위해 매력적인 방법으로하실 수 있습니다.

유전자 변형 벌레는 일반적으로 사용됩니다<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 연구. 설명은 DNA - 코팅 금 입자와 biolistic 폭격을 사용하여 웜로 transgenes을 소개, 효과 아직 간단한 프로토콜입니다. 참여 노력과 폭격의 결과는 유전자 변형 동물의 생성을 위해 microinjection과 호의를 비교합니다.

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

자유 생활 선충인 C. elegans를 사용하는 실험실의 수가 빠르게 증가하고 있습니다. 이 생물학적 모델의 인기는 빠른...

이 절차의 전반적인 목표는 생물학적 방법 또는 유전자 총(gene gun) transfection을 통해 형질전환 벌레를 생성하는 것입니다. 먼저 대량의 벌레를 배양한 다음, 금 입자에 DNA를 코팅하여 벌레에 발사하며, 이후 형질전환된 자손을 분리 및 회수하여 새로운 형질전환 라인을 구축합니다. 안녕하세요, 저는 피츠버그 대학교 의과대학 Alfred Fisher 박사 연구실의 Daniel Owa입니다.오늘은 형질전환 벌레(transgenic worms)를 생성하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희는 전사 인자에 의한 유전자 조절을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.Egg plate 준비는 Nystatin과 strep mycin이 첨가된 NGA 배지에 2% agar를 혼합하여 붓는 것으로 시작합니다. 10~50 cm 플레이트를 상온에서 건조시킵니다. 다음으로, 500 mL 병에 400 mL의 LB 배지를, 250 mL 플라스크에 40 mL의 LB 배지를 넣고 오토클레이브 멸균합니다.또한 빈 500 milliliter 병을 20분 동안 고압 증기 멸균하십시오. 멸균이 완료되면, LB 배지 40 milliliters에 streptomycin을 최종 농도가 200 micrograms per milliliter가 되도록 첨가하십시오. 그 다음 e coli 균주를 접종하십시오.OP 50-1. 배양액을 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 닭 달걀 10개의 노른자를 멸균된 500 mL 병에 넣습니다.LB 배지로 부피를 400 milliliters까지 맞춘 후 흔들어 균일한 용액을 만듭니다. 이 용액을 60 °C에서 1시간 동안 배양합니다. LB 혼합물이 실온으로 식으면, 40 milliliters의 ELI 배양액을 병에 넣고 흔들어 섞어줍니다.그다음, 준비된 NGA 플레이트에 배양액 5~8 mL를 피펫으로 분주합니다. 실온에서 하룻밤 동안 건조시킵니다. 다음 날, 남은 액체를 따라내고 실온에서 다시 하룻밤 더 건조합니다.이 시점에서 플레이트를 4 °C에서 1~2개월 동안 보관하거나 즉시 벌레를 접종할 수 있습니다. DP 38 CL 개체군을 다시 확장하려면, 최근에 굶긴 DP 38 벌레가 포함된 6 cm NGA 플레이트에 농축된 e coli OP 50을 접종하고 배양합니다. 알칼리성 차아염소산염 용액을 사용하여 DP 38 벌레로부터 알을 분리합니다.해당 절차는 첨부된 프로토콜에 설명되어 있습니다. 알을 분리한 후, S basal 또는 M9 완충액에 현탁합니다. 준비된 10 cm 알 플레이트 각각에 10,000개 이상의 알을 추가하고, 선충이 20 °C에서 7~10일 동안 성장하도록 둡니다.벌레들이 먹이를 다 먹기 시작하면, 플레이트를 입자 총격(bombardment)할 준비가 된 것입니다. 입자 총격을 위해 금 입자를 DNA로 코팅하려면, 1.7 milliliter 튜브에 60 milligrams의 금 입자를 넣습니다. 그 다음 70%ethanol을 추가하고 금 입자가 15분 동안 충분히 적셔지도록 둡니다.튜브를 짧게 원심 분리하여 금 입자를 침전시킵니다. 에탄올을 따라내어 제거합니다. 그런 다음 멸균수로 금 입자를 세 번 세척합니다.금 입자를 1 mL의 50% 멸균 글리세롤에 다시 현탁합니다. 금 입자 스톡 용액은 4 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다. 다음으로, s basil 또는 M line 버퍼를 사용하여 알 플레이트에서 벌레를 부상시켜 수집합니다.그런 다음 이를 50 milliliter 원심분리관으로 옮깁니다. 벌레들이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다립니다. 그런 다음 남은 완충액을 사용하여 튜브에서 2~3 milliliters의 완충액만 남기고 모두 흡입하여 제거합니다.웜을 얼음 위에서 고르게 냉각시킨 10 centimeter 무반점 NGA 플레이트로 옮깁니다. 웜을 플레이트 전체에 고르게 분산시킵니다. 그 다음 플레이트를 얼음 위에서 완전히 건조시킵니다.이렇게 하면 건조 과정 중에 벌레들이 뭉치는 것을 방지할 수 있습니다. 벌레들이 고르게 분포되어 있고, 충격 파쇄(bombardment) 절차 전에 플레이트가 완전히 건조되는 것이 중요합니다. DNA가 코팅된 금 입자를 준비하려면, 재현탁된 금 입자 50 µL를 1.7 mL 튜브에 넣으십시오.금 입자를 원심 분리하여 상층액을 제거합니다. 그 다음, 10~15 µg의 정제된 환형 또는 선형 목적 DNA와 새로 조제한 0.1 M spermine 20 µL의 혼합물을 첨가합니다. 마지막으로, 튜브를 부드럽게 볼텍싱하면서 2.5 M calcium chloride 50 µL를 가하고, 금 입자가 부유 상태를 유지하도록 주기적으로 혼합하며 얼음 위에서 30분 동안 혼합물을 배양합니다.30분 후, 금 입자 혼합물을 원심 분리합니다. 상층액을 빠르게 흡입하여 제거한 뒤 70% ethanol 300 µL로 세척하고, 이어서 100% Ethanol 1 mL로 세척합니다. 마지막으로 DNA가 코팅된 금 입자를 100% ethanol 170 µL에 재현탁합니다. 각 Bombardment를 위해 금 입자를 담을 매크로 캐리어 7개를 propanol 2개로 헹군 다음 실온에서 건조시킵니다.DNA-금 혼합물을 볼텍싱합니다. 그런 다음 각 매크로 캐리어의 중앙에 20 µL를 피펫팅합니다. 에탄올을 증발시킵니다.파열판을 Hector 어댑터에 삽입하고, 어댑터를 폭격 장치에 고정합니다. 그런 다음 7개의 매크로 캐리어를 홀더에 넣고 제공된 도구를 사용하여 안착시킵니다. 이어서 Hector 스톱 스크린과 바닥면을 홀더 위에 배치합니다.매크로 캐리어의 금색 점이 있는 면이 아래로 향하도록 홀더를 뒤집습니다. 그리고 위에서 두 번째 선반에 놓습니다. 매크로 캐리어 홀더 상단의 구멍을 Hector 어댑터의 배출구와 일치시킵니다.벌레가 도포된 NGA 플레이트의 뚜껑을 제거하고 이를 충격 챔버의 가장 낮은 선반에 놓습니다. 진공 유량 조절 노브를 완전히 열고, 챔버가 26 inches of mercury에 도달할 때까지 vac 버튼을 길게 누릅니다. 그 다음 hold 위치로 전환하여 진공 상태를 유지하고, 디스크가 파열될 때까지 fire 버튼을 길게 누릅니다.압력이 1,350 PSI에 도달하면 이 과정이 진행되며, 5초에서 20초 정도 소요될 수 있습니다. 버튼을 떼고, 밸브를 vent 위치로 전환하여 챔버의 진공을 해제한 다음 플레이트를 꺼냅니다. 헬륨 진공 장치를 끕니다.그런 다음 헬륨 라인이 깨끗해지고 헬륨 게이지가 0 PSI를 가리킬 때까지 발사 버튼을 여러 번 누릅니다. 마지막으로 PDS 1000 시스템의 전원을 끕니다. 이제 형질전환된 벌레들을 회수하여 입자 충격 후 배양할 수 있습니다.플레이트를 20 °C에서 20분 동안 둡니다. 그런 다음 S basil 또는 M9 버퍼 10 mL를 사용하여 플레이트에서 벌레를 띄워 옮깁니다. 버퍼에 섞인 벌레 0.5 mL를 10 cm spotted NGA 플레이트에 접종합니다. 그 후 플레이트를 실온에서 약 2주 동안 보관합니다.트랜스진에 의한 UNC-19 표현형의 회복 여부를 스크리닝하고, 회복된 벌레가 포함된 각 10 centimeter 플레이트에서 하나의 개별 라인을 구축하십시오. 형질전환 동물을 얻는 본 프로토콜의 성공 여부는 특정 트랜스진에 따라 달라집니다. 프로모터 GFP 리포터 트랜스진의 경우, 최대 20개의 라인을 확보하였습니다.보다 일반적인 결과는 3~10개의 라인이 얻어지는 것입니다. 형질전환 라인의 최대 30%가 통합 라인이지만, 이는 무작위적으로 발생하므로 통합 라인이 특히 필요한 경우에는 하루에 여러 번의 bombardment를 수행합니다. 그림은 transgene bombardment로 구제된 19마리의 mutant worm이 포함된 대표적인 10 centimeter 플레이트를 보여줍니다.구조된 벌레는 형질전환되지 않은 벌레에 비해 크기가 더 크고 운동성이 훨씬 향상된 것으로 식별할 수 있습니다. 19개 돌연변이 중 하나에서 GFP 트랜스진으로 형질전환되어 구조된 벌레를 분리하면 GFP 발현이 나타납니다.이 트랜스진은 형질전환 웜의 장과 하피에서 GFP를 강력하게 발현합니다. 이 특정 트랜스진은 웜의 염색체에 통합되어 있으며, 자손의 100%가 트랜스진을 발현합니다. 방금 이 절차를 수행할 때 C. elegans의 바이오 홀리스틱 밤바드먼트(bio holistic bombardment)를 수행하는 방법을 보여드렸습니다.충분한 양의 벌레를 배양하고 신선한 투과막을 사용하는 것이 중요합니다. 이것으로 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 귀하의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

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