트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

형질전환 동물에서 형광 리포터의 발현을 통해 살아있는 질환 모델에서 실험적 조작에 따른 세포 반응을 추적하는 것이 가능해졌습니다. 본 실험에서는 제브라피쉬에서 약물을 이용하여 선택적인 세포 소실을 유도하고, 고해상도 다색 공초점 이미징을 통해 표적 세포와 그 인접 세포들의 이미지를 약물 처리 직전, 직후 및 이후 일정 간격으로 획득하였습니다. 이미지 분석 결과, 회복 단계 동안 내인성 줄기세포 집단의 활성화와 그에 따른 표적 세포의 대체가 일어남을 확인하였습니다.

이 방법은 개별 세포 유형을 재생하는 데 사용되는 세포 및 분자 기전은 무엇인가와 같이 재생 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 수정 후 16시간에 교배를 통해 수집한 형질전환란을 0.3 x danio solution이 담긴 페트리 접시로 옮기는 것으로 시작하십시오. 관심 조직에 색소 침착의 증거가 나타나기 전에 tyrosine ACE 활성을 억제하기 위해 PTU를 첨가하십시오. 배아가 알비노가 아닌 경우, 배아를 28.5 °C에서 배양하십시오.

리포터가 확인되면, 페트리 접시를 형광 스테레오 줌 현미경 아래에 두고 원하는 트랜스진 발현 여부에 따라 분류합니다. 이미징을 하기 전, 배아 배지 내에 0.5% low melt aeros 마운팅 용액을 준비하여 40 °C에서 보관합니다.

필요한 경우 trica와 PTU를 첨가합니다. 부드럽게 혼합한 후 40°C로 되돌립니다. trica가 포함된 배아 배지에 물고기를 넣어 마취시킵니다.

약 3분 동안 물고기가 반응하지 않는 상태가 됩니다. 마이크로 피펫을 사용하여 물고기를 접촉시키려면, 약 30 µL의 마취액이 담긴 절단된 피펫 팁으로 물고기를 개별적으로 흡입하십시오. 다음으로, 피펫을 뒤집어 물고기가 바닥에 가라앉도록 합니다.

팁을 마운팅 용액에 접촉시켜 중력에 의해 옮겨지도록 합니다. agro가 희석되어 재사용이 불가능해지지 않도록 주의하십시오. 마이크로 피펫에 남은 마취 용액은 폐기합니다.

그런 다음 동일한 팁을 사용하여 물고기를 페트리 접시로 옮깁니다. 약 30 µL의 마운팅 용액 내에서, 관심 영역이 에어로스(aeros) 방울의 중심에 오도록 물고기를 조심스럽게 배치합니다. 에어로스가 응고될 때까지 물고기가 원하는 방향을 유지하도록 하십시오.

원하는 경우 단일 페트리 접시에 여러 마리의 물고기를 고정할 수 있습니다. 에어로졸이 응고된 후, 물고기를 공초점 현미경 스테이지로 옮기고 물고기가 완전히 잠길 때까지 PTU 포함 여부에 따른 trica 함유 배아 배지를 접시에 조심스럽게 추가합니다. 이미징 소프트웨어를 열고 세포 및 분자적 세부 사항의 최적 이미징을 위해 관심 영역에 초점을 맞춥니다.

소프트웨어에서 높은 개구수를 가진 장작동거리 대물렌즈를 사용하십시오. 다이얼 목록에서 적절한 형광 채널을 선택하십시오. 스펙트럼 설정을 클릭하고 방출 범위를 조정하십시오.

리포터 신호를 깨끗하게 분리하고 신호 대 잡음비를 최대화하기 위해, 드롭다운 메뉴에서 적절한 대물렌즈를 선택하여 소프트웨어 정의 프리셋이 올바르게 조정되었는지 확인하십시오. 레이저의 초점을 맞추고 출력 레벨을 설정하려면, 각 채널의 픽셀 포화도가 나타나는 룩업 테이블의 출력을 선택하십시오.

다음으로, 원하는 이미지 품질을 얻을 수 있도록 검출기 감도를 설정하고, 이미지 강도가 적절해질 때까지 레이저 출력을 서서히 높입니다. 관심 영역에서 픽셀 포화가 일어나지 않도록 주의하고, 광퇴색 및 광독성 문제를 줄이기 위해 레이저 레벨을 가능한 한 낮게 유지하십시오.

모든 이미징 채널을 모니터링하면서 레이저를 수동으로 켜고 꺼서, 각 레이저 라인이 적절한 채널에서만 검출 가능한 신호를 생성하는지 확인하십시오. 크로스톡(crosstalk)이 나타나지 않는 경우, 모든 채널을 동시에 획득할 수 있습니다. 그다음, 줌 및 회전 기능을 사용하여 관심 영역의 구도를 잡으십시오.

그다음 스캔 속도와 이미지 크기를 설정합니다. 더 빠른 스캔 속도를 사용하면 레이저 체류 시간이 최소화되고 시간 분해능이 향상됩니다. 실험적 필요에 따라 Z 차원 단계 크기를 설정하십시오. 여기서는 망막 조직의 7개 광학 단면을 촬영하기 위해 10 microns의 단계 크기를 사용하였습니다.

적절한 설정값이 결정되면 Zack 이미지를 획득하여 저장합니다. 그 다음 다음 물고기로 이동합니다. 동봉된 서면 문서의 지침에 따라, 수일에 걸친 세포 변화를 추적하기 위해 연속적인 포획 및 방사 이미징을 수행할 수 있습니다.

다중 리포터 이미지 분석 실험을 수행할 때, 스펙트럼상으로 충분히 분리된 형광 표지를 사용하는 것이 가장 좋으나 항상 실용적인 것은 아닙니다. 본 영상에서는 오픈 소스 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 들뜸 및 방출 프로파일이 겹치는 형광 표지를 분리하는 간단한 이미지 감산법을 보여드립니다. 본 사례에서는 GFP와 YFP를 사용하였습니다.

본 영상에서 설명하는 타임랩스 이미징 기술은 망막 양극 신경세포의 절제 및 재생 과정 동안 GFP가 표지된 망막 줄기세포를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 스펙트럼 분리를 수행하려면 순차 이미징 모드와 가변 배리어 필터 설정을 사용하여 이미지를 수집하십시오. 이를 통해 중첩되는 형광 신호를 각각 독립적으로 획득하거나 부분적으로 분리하여 획득할 수 있습니다. 이미지 획득이 완료되면, ImageJ loci bio formas import를 사용하여 이미지 파일을 열고 임포트 도구를 시작하십시오. 분석하고자 하는 파일을 ImageJ 창으로 드래그하십시오.

align three TP 플러그인을 시작하려면 가져오기 창의 채널 분할(split channels) 체크박스를 사용하여 채널을 개별 스택으로 분리하십시오. 플러그인(plugins)을 클릭한 다음, 스택 정렬(align stacks)을 선택하고, align three tp를 선택하십시오.

정확한 감산을 위해 스택을 정렬해야 합니다. 첫 번째 드롭다운 박스에서 기준 스택을 선택하고, 두 번째 박스에서 정렬되지 않은 스택을 선택하십시오. use XY relative origin 및 use Z relative origin 박스를 체크한 후 okay를 클릭하십시오.

정렬 프로세스를 시작하려면 볼륨 등록 버튼을 클릭하십시오. 정렬 파라미터가 포함된 새 창이 나타납니다. 확인을 클릭하십시오.

이 섹션은 플러그인 배포자에 의해 최적화되었으므로 수정이 필요하지 않습니다. 작업이 완료되면 정렬된 스택 창이 나타납니다. 출력 창을 열려면 정렬된 창에서 출력을 선택하십시오.

이 창 또한 최적화되어 있어 수정할 필요가 없습니다. 확인을 클릭하십시오. 파일 제목 끝에 aligned가 추가된 새로운 스택이 워크스페이스에 나타납니다.

이미지 계산기(image calculator)를 사용하여 크로스토크(crosstalk)를 제거하려면, Process를 클릭한 다음 Image Calculator를 선택하십시오. Image one 드롭다운 박스에서 뺄셈 대상이 될 스택을 선택하고, Image two 드롭다운 박스에서 뺄셈에 사용할 스택을 선택하십시오. Operation 드롭다운 박스에서 Subtract를 선택하고 OK를 클릭하십시오.

Image J에서 스택 처리 여부를 묻는 메시지가 나타나면 '예'를 선택하십시오. 중첩된 채널 간의 크로스토크(crosstalk)가 제거된 새로운 스택이 생성됩니다.

정렬 및 감산 전과 동일한 이미지 구조를 재구성하기 위해 스택을 병합합니다. 채널 도구 창에서 병합할 채널을 선택하면, 해당 도구를 통해 최대 4개의 스택을 하이퍼 스택(hyper stack)으로 병합할 수 있습니다. 마지막으로 채널별로 색상을 지정하고 밝기와 대비를 조절한 후, nitro reductase의 표적 손실 및 재생을 분석하기 위해 파일을 tiff 형식으로 저장합니다.

M cherry를 발현하는 망막 양극세포. 처리 전 개별 제브라피쉬에서 시간에 따른 공초점 이미지를 촬영하였습니다. 대조군 양극세포에서 막 표지 YFP 리포터가 노란색으로 모자이크 발현되며, 표적 양극세포에서는 니트로 리덕타제 cherry 융합 단백질이 빨간색으로 발현됩니다.

청색으로 표시된 막 결합 CFP 트랜스젠은 명확성을 높이기 위해 다른 대부분의 망막 세포에 대한 맥락적 정보를 제공합니다. CFP 신호가 없는 동일한 이미지는 메트로니다졸 처리 후에 나타납니다. 적색의 니트로 환원효소 발현 양극 세포는 소실된 반면, 황색의 대조군 양극 세포는 보존되었습니다.

이는 본 절제 방법론의 매우 특이적인 성격을 입증합니다. 명확성을 위해 CFP가 없는 동일한 이미지를 다시 보여줍니다. metro NIAZ가 제거되면, NTR을 발현하는 세포들이 이곳으로 다시 돌아옵니다.

G-F-P-Y-F-P 감산법의 예시가 이 그림(GFP 표지 뮬러 글리아 세포)에 나와 있습니다. GL 세포는 녹색으로, YFP 표지 양극 세포는 보라색으로 표시됩니다. 두 세포의 중첩 부위는 흰색으로 나타나며, 이를 통해 감산을 수행합니다.

먼저 GFP와 YFP 이미지를 정렬해야 합니다. 그런 다음 감산 과정을 통해 YFP로 표지된 양극세포를 GFP 이미지에서 제거함으로써, GFP로 표지된 뮬러 글리아(Mueller glia)를 명확하게 나타내고 더 어두운 뮬러 세포를 검출할 수 있습니다. 이제 빨간색으로 표시된 어두운 뮬러 글리아와 M-cherry로 표지된 양극세포 사이의 중첩 여부를 확인할 수 있습니다.

여기에 제시된 데이터는 양극세포 제거가 소실된 세포를 대체하기 위해 뮐러 글리아(mullar ggl)를 자극한다는 것을 시사합니다. 이러한 해석은 포유류와 어류 모두에서 뮐러 글리아(Mueller Ggl)를 손상 유도 전구세포로 지목하는 최근의 망막 재생 연구들과 일치합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 제브라피쉬의 줄기세포 시각화를 통해 특정 세포 유형의 재생을 조절하는 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.