Name: 트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 배우세요 다색 공초점 타임랩스 영상과 표적 세포 절제 기술을 사용하여 Danio rerio에서 망막 줄기 세포 활성화와 신경 재생 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 세포 특이적 재생 과정을 실시간으로 추적할 수 있습니다.

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우리는 DRS 감사하고 싶습니다. 미라 Saxena 및 원고에 도움이 덧글에 대한 조나단 마타. 우리는 DRS 감사합니다. 형질 라인을 제공하는 마이클 파슨스, 파멜라 레이먼, 그리고 레이첼 웡. 동물 실험 프로토콜 07-12-003을 승인 MCG IACUC에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었습니다 * B. 이 작품은 JSM에 NIH R21 MH083614과 천 바실 O 코너 초보 학술 상을 월 지원했습니다

<ol><li>Köster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+microscopy+of+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse microscopy of brain development.</a> Methods Cell Biol. 76, 207-235 (2004).</li>
<li>Mumm, J. S., Williams, P. R., Godinho, L., Koerber, A., Pittman, A. J., Roeser, T., Chien, C. B., Baier, H., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+dendritic+targeting+of+laminated+afferents+by+zebrafish+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals dendritic targeting of laminated afferents by zebrafish retinal ganglion cells.</a> Neuron. 52, 609-621 (2006).</li>
<li>Curado, S., Anderson, R. M., Jungblut, B., Mumm, J., Schroeter, E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Dev Dyn. 236, 1025-1035 (2007).</li>
<li>Ren, J. Q., McCarthy, W. R., Zhang, H., Adolph, A. R., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+visual+responses+of+wild-type+and+hypopigmented+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Behavioral visual responses of wild-type and hypopigmented zebrafish.</a> Vision Res. 42, 293-299 (2002).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+Coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. Coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124, 218-229 (2007).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+cell+motility+and+actin+cytoskeleton+of+individual+neurons+and+neural+crest+cells+in%0A++zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of cell motility and actin cytoskeleton of individual neurons and neural crest cells in
 zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+zebrafish+embryonic+brain+by%0A++confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the zebrafish embryonic brain by
 confocal microscopy.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

JSM은 zebrafish의 세포 절제의 nitroreductase 기반 시스템 (멈 JS, 그리고 Schroeter, Zebrafish &quot;미국 특허 7,514,595에서 EH 타겟 지역 박리 세포 절제. 2009년 4월 7일)의 사용에 대한 특허를 획득했습니다.이 기법은 도구 및 JSM은 설립과 서비스를 생명 공학 회사, Luminomics 주식 회사에 대한 일반적인 플랫폼으로 사용하는 것은 인치 이해 관계자 남아

이 비디오에서는, 우리는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 사용 기술의 개요가 제공됩니다. 타겟 세포 절제가 신경 회로 기능과 세포 고유의 연결을 재생 패러다임을 연구하는 데 사용하는 동안 우리는 생체내에 대한 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 시간 저속 영상을 사용합니다. 예제는 이러한 방식에서 gleaned 수있는 몇 가지 장점을 강조 표시됩니다. 아마도 가장 중요한 시간 경과 영상은 내부 통제 패러다임을 제공 관찰 모든 현상은 이전 상태로 다시 관련되어 있습니다. 이것은 직접보다는 유추 비교가 수치 쉽게 상대적인 변화를 만들고 인구 내에서 변화와 관련된 실험 &#39;소음&#39;을 감소 실험 시간이 지점에 걸쳐 만들 수 있습니다. 여러 가지 빛깔의 이미지의 장점은 상호 작용 및 / 또는 인접 세포 유형의 변화를 시각화하는 능력입니다. 예를 들어, 멀러 glia를 라벨 유전자 변형 라인을 사용하여, 우리는 이제 개별 망막 세포 subpopulations의 손실이 잠재적인 부상을 유발 줄기 세포의 반응을 특성화하고 있습니다. 우리는 또한 신경 회로 형성 2 소설 메커니즘을 정의하기 위해이 방법을 사용했습니다. 마지막으로, 세포 재생 연구 이외에, 우리는 최근의 연결 subtypes의 기능 역할을 다양한 행동 패러다임과 electrophysiological assays을 사용하므로 개별 신경 회로를 조사하기 위해 NTR 기반 절제 시스템을 사용하기 시작했습니다. 이러한 연구 zebrafish을 고용의 독특한 장점은 자신의 재생 능력으로 인해, 유도의 적자가 일시 그입니다. 따라서, 시간 저속 영상 assays과 연관하여 우리는 reinnervation의 메커니즘을 초래할뿐만 아니라, 기능 회복에 필요한 reinnervation의 범위를 typify 수 있습니다. 제공 방법은 여러 가지 질문에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 절제와 중생의 유사한 분석은 어떤 transgenically 정의 셀룰러 subtype에 적용할 수 있습니다. 이하 이러한 연구가 개별 세포 유형의 수준과 이산 줄기 세포 틈새 내에서 재생에 대한 우리의 이해를 확장 가능성이있다.

1. 시약 : Danieau의 솔루션 : <ul><li> 나트륨 염화물 (피셔, S271 1) </li><li> 염화칼륨 (피셔, P217 500) </li><li> HEPES (피셔, BP310500) </li><li> 마그네슘 황산 (피셔, M65 500) </li><li> 칼슘 질산 (피셔, C109500) </li><li> 페니실린 - 스트렙토 마이신 (피셔, ICN1670049) </li></ul> 기타 시약 : <ul><li> 낮은 용융 아가로 오스 (피셔, BP165 - 25) </li><li> Tricane methanesulfonate (피셔, NC9435281) </li><li> N - phenylthiourea (피셔, NC9968868) </li><li> 메트로니다졸 (피셔, AC21034 - 1000) </li></ul> 2. 소모품 : <ul><li> 딥 배양 - 요리 (피셔 과학 / 코닝, 08-772-32) </li><li> 더몬트 # 5 멋진 포셉 (피셔, NC9404145) </li></ul> 3. 장비 : <ul><li> 줌 입체경 (올림푸스, SZ51) </li><li> 형광 줌 입체경 (올림푸스, SZX16) </li><li> 공촛점 현미경 (올림푸스 FV1000) </li><li> 디지털 블록 히터 - Isotemp (피셔, 11-715 - 125DQ) </li><li> 반스 테드 / Thermolyne Benchtop 보육 (피셔, 11-702-4). </li></ul>

트렌스 제닉 zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

살아있는 zebrafish의 애벌레의 고해상도 시간 경과 영상은 방법을 생물 학적 과정이 (검토를 위해 1 참조) 펼쳐 시각화에 활용하실 수 있습니다. 이웃 세포 ​​유형에서 다른 형광 기자를 표현 화합물 유전자 변형 물고기는 시간이 지남에 따라 실험적인 조작을 세포 상호 작용이 및 / 또는 조직 수준의 답변을 다음과 같은 수단을 제공합니다. 이 비디오에서는, 우리는 며칠 분 거리에 걸쳐 수있는 시간이 코스를 통해 각각의 물고기에 순차적으로 이미징 여러 transgenically 표시 셀 유형에 대해 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. ) 분리에 대한 단순화된 접근 방식 1) 직렬 &#39;잡으 및 릴리스&#39;이미징을위한 방법 연속 일, 2 이상의 물고기가 많은 : 설명 기술을 포함하여, 시간이 지남에 인접한 세포 유형의 &quot;행동&quot;을 상호 연관하고자하는 모든 연구에 적용 중복 여기 / 방출 프로파일 (예 : GFP 및 YFP), 3) 개발, 4 후반 애벌레 단계로 고해상도 이미징을위한 시간 창 사용할 수 연장 hypopigmented 돌연변이 라인의 사용) 형광 기자가 공개를 타겟으로 막의 사용 fluorophores 개별 세포뿐만 아니라 세포의 큰 인구에있는 세포 자세한 내용 및 transgenically 타겟 세포 유형의 화학을 이용한 절제 5) 이전에 설명한 방법을 잘 형태학의 세부 사항; 같은 메트로니다졸 같은 즉, nitroreductase (NTR) prodrug 기판의 중재 변환, (MTZ), 세포 독성 파생 3,5 수 있습니다. 이러한 접근 방법의 예를 들어, 우리는 며칠 동안 개별 생선 이내에 망막 신경 세포 양극성의 subtype의 절제와 재생을 시각화합니다. 동시에 우리는 이웃 아닌 타겟 바이폴라 전지 및 잠재적인 변성 자극 망막 줄기 세포 (즉, Mϋller의 glia)을 포함한 여러 다른 망막 세포 유형을 모니터합니다. 이 전략은 타겟의 연결을 세포 유형의 선택 상실과 재생을 세포 및 조직 수준 (예를 들어, 줄기 세포 틈새) 응답을 특성화하기 위해 실험실에 적용되고 있습니다.

이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데 사용됩니다<em&gt; 생체내에</em&gt;. 타겟 세포 절제는 학습 신경 회로 기능과 세포 고유의 연결을 재생 패러다임을 용이하게합니다.

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

살아있는 제브라피쉬 치어의 고해상도 타임랩스 이미징은 생물학적 과정이 어떻게 전개되는지 시각화하는 데 활용될 수 있다(리뷰는 1 참조). 화합물 ...

형질 전환 동물의 형광 리포터 발현을 통해 살아있는 질병 모델에서 실험적 조작에 따른 세포 반응을 추적할 수 있습니다. 본 실험에서는 제브라피시에서 약물로 선택적 세포 소실을 유도하고, 고해상도 다색 공초점 이미지로 표적 세포와 인접 세포를 약물 처리 전, 처리 직후, 그리고 일정 간격으로 획득하였습니다. 이미지 분석 결과, 회복 단계 동안 내인성 줄기세포 집단의 활성화와 그에 따른 표적 세포의 대체가 일어남을 확인하였습니다.이 방법은 개별 세포 유형을 재생하는 데 사용되는 세포 및 분자 메커니즘은 무엇인가와 같은 재생 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 수정 후 16시간에 교배를 통해 수집한 형질 전환란을 0.3 x danio solution이 담긴 페트리 접시에 옮기는 것으로 시작하십시오. 관심 조직에 색소 침착 증거가 나타나기 전에 PTU를 첨가하여 티로시나제(tyrosine ACE) 활성을 억제하십시오. 배아가 알비노가 아닌 경우, 배아를 28.5 °C에서 배양하십시오.리포터가 확인되면, 페트리 접시를 형광 실체 줌 현미경 아래에 두고 원하는 트랜스진 발현 여부에 따라 분류합니다. 이미징 전에, 배아 배지에서 0.5% low melt aeros 마운팅 용액을 준비하여 40 °C에서 보관하십시오.필요한 경우 trica와 PTU를 첨가하십시오. 부드럽게 혼합한 후 40 °C로 되돌립니다. trica가 포함된 배아 배지에 물고기를 넣어 마취시키십시오.약 3분 동안 물고기는 반응하지 않는 상태가 됩니다. 마이크로 파이펫을 사용하여 물고기를 옮기려면, 끝을 잘라낸 파이펫 팁에 약 30 µL의 마취액과 함께 개별 물고기를 흡입하십시오. 그다음, 파이펫을 뒤집어 물고기가 바닥에 가라앉도록 합니다.팁을 마운팅 용액에 접촉시켜 중력에 의해 옮겨지도록 합니다. 마취제가 희석되지 않도록 주의하여 재사용할 수 있게 합니다. 마이크로 피펫에 남은 마취제 용액은 버립니다.그런 다음 동일한 팁을 사용하여 물고기를 페트리 접시에 옮깁니다. 약 30 µL의 마운팅 용액 내에서, 관심 영역이 에어로스 방울 중앙에 오도록 물고기의 방향을 조심스럽게 잡습니다. 에어로스가 굳을 때까지 물고기가 원하는 방향을 유지하도록 하십시오.원하는 경우 한 개의 Petri dish에 여러 마리의 물고기를 고정할 수 있습니다. aeros가 응고된 후, 물고기를 공초점 현미경 스테이지로 옮기고 물고기가 완전히 잠길 때까지 trica와 PTU 포함 여부에 따른 배아 배지를 dish에 조심스럽게 첨가합니다. 이미징 소프트웨어를 실행하고 세포 또는 분자 세부 사항을 최적으로 촬영할 수 있도록 관심 영역에 초점을 맞춥니다.소프트웨어에서 수치 구경(numerical aperture)이 높은 장작업거리(long working distance) 대물렌즈를 사용하십시오. 다이얼 목록에서 적절한 형광 채널(flora fours)을 선택하십시오. 스펙트럼 설정(spectral setting)을 클릭하고 방출 범위(emission ranges)를 조정하십시오.리포터 신호를 깨끗하게 분리하고 신호 대 잡음비를 최대화하십시오. 소프트웨어로 정의된 사전 설정값이 적절하게 조정되도록 드롭다운 메뉴에서 적절한 대물렌즈를 선택하십시오. 레이저의 초점을 맞추고 출력 레벨을 설정하려면, 각 채널에서 픽셀 포화가 나타나는 출력값을 조회 테이블에서 선택하십시오.다음으로, 원하는 이미지 품질을 얻을 수 있도록 검출기 감도를 설정하고, 이미지 강도가 적절해질 때까지 레이저 출력을 점진적으로 높입니다. 관심 영역에서 픽셀 포화가 일어나지 않도록 주의하고, 광퇴색 및 광독성 문제를 줄이기 위해 레이저 레벨을 가능한 한 낮게 유지하십시오.모든 이미징 채널을 모니터링하면서 레이저를 수동으로 켜고 끄며, 각 레이저 라인이 해당 채널에서만 검출 가능한 신호를 생성하는지 확인하십시오. 크로스토크가 나타나지 않는다면 모든 채널을 동시에 획득할 수 있습니다. 다음으로, 줌 및 회전 기능을 사용하여 관심 영역의 프레임을 잡으십시오.그 다음, 스캔 속도와 이미지 크기를 설정합니다. 더 빠른 스캔 속도를 사용하면 레이저 체류 시간이 최소화되고 시간 분해능이 향상됩니다. Z축 차원의 단계 크기는 실험적 필요에 따라 설정하십시오. 여기서는 망막 조직의 7개 광학 단면을 촬영하기 위해 10 microns의 단계 크기를 사용하였습니다.적절한 설정이 결정되면 Zack 이미지를 획득하여 저장합니다. 그런 다음 다음 물고기로 이동합니다. 동봉된 서면 문서의 지침에 따라 며칠에 걸쳐 세포 변화를 추적하기 위해 연속적인 포획 및 방류 이미징을 수행할 수 있습니다.다중 리포터 이미징 실험을 수행할 때는 서로 충분히 분리된 형광 색소를 사용하는 것이 가장 좋지만, 실제로는 그것이 항상 실용적인 것은 아닙니다. 본 영상에서는 오픈 소스 소프트웨어인 Image J를 이용해 들뜸 및 방출 프로파일이 겹치는 형광 색소를 분리하는 간단한 이미지 감산 방법을 소개합니다. 본 사례에서는 GFP와 YFP를 사용하였습니다.본 영상에서 설명하는 타임랩스 이미징 기법은 망막 양극 신경세포의 절제 및 재생 과정 동안 GFP로 표지된 망막 줄기세포를 모니터링하는 데 사용되었습니다. 스펙트럼 분리를 수행하려면 순차 이미징 모드와 가변 배리어 필터 설정을 사용하여 이미지를 수집하십시오. 이를 통해 중첩되는 형광들을 각각 독립적으로 획득하거나 부분적으로 분리하여 획득할 수 있습니다. 이미지 획득이 완료되면, ImageJ loci bio formas 임포트를 사용하여 이미지 파일을 열고 임포트 도구를 시작하십시오. 분석하고자 하는 파일을 ImageJ 창으로 드래그하십시오.Import 창의 split channels 체크박스를 사용하여 채널을 개별 스택으로 분리한 후 align three TP 플러그인을 시작하십시오. plugins를 클릭한 다음, align stacks를 선택하십시오. 이어서 align three tp를 클릭하십시오.정확한 뺄셈(subtraction)을 위해 스택의 정렬이 필요합니다. 첫 번째 드롭다운 박스에서 참조 스택을 선택하고, 두 번째 박스에서 정렬되지 않은 스택을 선택하십시오. use XY relative origin과 use Z relative origin 확인란을 선택한 후 okay를 클릭하십시오.정렬 프로세스를 시작하려면 볼륨 등록 버튼을 클릭하십시오. 정렬 파라미터가 포함된 새 창이 나타납니다. 확인을 클릭하십시오.이 섹션은 플러그인 배포업체에 의해 최적화되었으므로 수정이 필요하지 않습니다. 완료되면 정렬된 스택 창이 나타납니다. 출력 창을 열려면 정렬된 창에서 출력을 선택하십시오.이 창 또한 최적화되어 있어 수정이 필요 없습니다. 확인을 클릭하십시오. 파일 제목 끝에 aligned가 추가된 새로운 스택이 작업 공간에 나타납니다.이미지 계산기(image calculator)를 사용하여 크로스토크(crosstalk)를 제거하려면, process를 클릭한 다음 image calculator를 선택하십시오. image one 드롭다운 상자에서 차감될 스택을 선택하고, image two 드롭다운 상자에서 차감에 사용할 스택을 선택하십시오. operation 드롭다운 상자에서 subtract를 선택한 후 okay를 클릭하십시오.Image J에서 스택 처리 여부를 묻는 창이 나타나면 'yes'를 선택하십시오. 중첩된 채널 간의 크로스토크(crosstalk)가 제거된 새로운 스택이 생성됩니다.정렬 및 감산 전과 동일한 이미지 구조를 재현하기 위해 스택을 병합하십시오. 채널 도구 창에서 병합할 채널을 선택하면 최대 4개의 스택을 하이퍼 스택으로 병합할 수 있습니다. 마지막으로, 채널에 색상을 입히고 밝기와 대비를 조절한 후 파일을 tiff 형식으로 저장하여 nitro reductase의 표적 손실 및 재생을 분석하십시오.M cherry를 발현하는 망막 양극 세포. 처리 전 개별 제브라피쉬에서 촬영한 공초점 이미지의 시계열 데이터이다. 노란색으로 표시된 대조군 양극 세포에서는 막 표지 YFP 리포터가 모자이크 형태로 발현되며, 빨간색으로 표시된 표적 양극 세포에서는 니트로 리덕타제 cherry 융합 단백질이 발현된다.청색으로 표시된 막 결합 CFP 트랜스진은 명확성을 높이기 위해 대부분의 다른 망막 세포에 대한 맥락 정보를 제공합니다. CFP 신호가 없는 동일한 이미지가 메트로니다졸 처리 후에 나타납니다. 적색의 니트로리덕타아제를 발현하는 양극세포는 소실된 반면, 황색의 대조군 양극세포는 보존되었습니다.이는 이 절제 방법론의 매우 특이적인 성격을 보여줍니다. 다시 한번, 명확한 확인을 위해 CFP가 없는 동일한 이미지를 보여줍니다. metro NIAZ가 제거되면, NTR을 발현하는 세포들이 이곳으로 다시 돌아옵니다.G-F-P-Y-F-P 감산법의 예가 이 그림의 GFP 표지 Mueller GL 세포(녹색)와 YFP 표지 양극 세포(보라색)에서 나타나 있습니다. 두 색상의 겹침 영역은 흰색으로 표시되며, 이를 통해 감산을 수행합니다.먼저 GFP와 YFP 이미지를 정렬해야 합니다. 이후 감산 과정을 통해 GFP 이미지에서 YFP로 표지된 양극세포를 제거함으로써, GFP로 표지된 뮐러 글리아(Mueller glia)를 명확하게 나타내고 더 어두운 뮐러 세포를 검출할 수 있습니다. 이제 빨간색으로 표시된 어두운 뮐러 글리아와 M cherry로 표지된 양극세포 간의 중첩을 확인할 수 있습니다.여기에 제시된 데이터는 양극세포(bipolar cell) 절제가 뮐러 글리아(muller ggl)를 자극하여 소실된 세포를 대체하도록 한다는 점을 시사합니다. 이러한 해석은 포유류와 어류 모두에서 뮐러 글리아가 손상 유도 전구세포로 작용한다는 최근의 망막 재생 연구들과 일치합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 제브라피시의 줄기세포 시각화를 통해 특정 세포 유형의 재생을 조절하는 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

multicolor-time-lapse-imaging-transgenic-zebrafish-visualizing

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

출처: Muto, A., et al. 이광자 레이저를 사용한 신경 세포 집단의 절제 및 제브라피시 유충의 칼슘 이미징 및 행동 기록을 사용한 평가.J. Vis. Exp. (2018) 이 비디오에서,  이광자 레이저 절제 절차가 시연되어 아가로스에 고정된 제브라피시 유충에서 형광 뉴런을 선택적으로 파괴할 수 있습니다. 시술 전후의 고해상도 이미징은 형광의 부재로 관찰되는 바와 같이 효율적인 신경 손상을 확인합니다.

제브라피시 라라바(Larava)에서 이광자 현미경을 사용한 표적 신경 세포 절제

출처: Lahne, M., et.al. 다광자 현미경에 의한 라이브 셀 이미징을 위한 성체 형질전환 제브라피시 망막 외식의 배양. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 빛에 의한 광수용체 손상 후 아가로스가 박힌 제브라피시 망막 이식에서 Muller 신경교세포 핵 이동의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 손상된 광수용체에 의해 방출된 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)는 뮐러 신경교세포(Muller glial cell)를 활성화하여 유사분열 및 신경 전구 생성(neuronal progenitor) 생성을 위해 내핵층과 외핵층을 통한 핵 이동을 유발합니다. 캡처된 이미지는 망막 재생 중 핵 이동과 전구 세포 분화의 역학을 보여줍니다.

제브라피시 망막 재생 중 Muller Glial 핵 이동의 라이브 셀 이미징

출처: Williams, A. L., et al. 실시간 발달을 시각화하기 위한 다광자 타임랩스 이미징: 제브라피시 배아에서 이동하는 신경 능선 세포의 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 제브라피시 배아의 신경능선 세포의 이동을 고해상도로 실시간으로 시각화하기 위한 다광자 타임 랩스 이미징 프로토콜을 보여줍니다.

다광자 타임랩스 이미징을 사용한 제브라피시 배아의 신경능선세포 이동 시각화

말초 신경계 (PNS)가 부상 후 중요한 수리 할 수​​ 있지만, 거의가이 현상을 제어하는​​ 세포 및 분자 메커니즘에 대해 잘 알려져 있습니다. 라이브 형질 전환 제브라 피쉬와 재현 신경 절개 분석하여, 우리는 신경 변성과 재생 중에 동적 아교 세포의 행동을 공부할 수 있습니다.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

레이저 스캐닝 현미경 검사 법 긴 파장 다중 광자 형광 여기의 고급 광학 기술의 조합 안내 (sox10:EGFP)에 안내 (foxd3:GFP) zebrafish 태아 신경 크레스트 마이그레이션의 고해상도, 3 차원, 실시간 영상 캡처 구현 되었습니다.

실시간으로 개발을 시각화 하기 위해 다중 광자 시간 경과 영상: 마이그레이션 Zebrafish 태아 신경 크레스트 셀의 시각화

생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

배우세요 다색 공초점 타임랩스 영상과 표적 세포 절제 기술을 사용하여 Danio rerio에서 망막 줄기 세포 활성화와 신경 재생 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기법은 세포 특이적 재생 과정을 실시간으로 추적할 수 있습니다.

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

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