Name: Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 배우세요 Drosophila 애벌레의 생체내 시냅틱 소포 운동을 형광 현미경으로 관찰하는 방법입니다. GFP 표지 단백질을 이용한 축삭 수송 연구에 활용됩니다.

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SG는 버팔로의 뉴욕 주립 대학에서와 존 R. Oishei 재단 기금에 의해 지원됩니다. MK는 UB의 CURCA하여 학생 연구 수상에 의해 지원되었다.

1. 시약의 준비 <ol><li> 7.2 및 필터 소독 128 MM NaCl, 1mM EGTA, 4 MM MgCl 2, KCl 2mM, 5mM HEPES, 1000 ML, PH 36 MM의 자당 다음 화합물을 추가하여 해부 버퍼 준비를 준비합니다. </li></ol> 2. 해부를위한 준비 <ol><li> Siligard 큐브 : 겔은 약 인치 와이드, 1 인치 길이 높이 약 1cm로 잘라입니다. 겔 큐브는 절개 중에 유리 슬라이드에 배치됩니다. 큐브는 두 번 이상 사용할 수 있습니다. </li><li> 핀 : 해부에 사용되는 핀 짧게 추가해야합니다. minutien 핀의 날카로운 아래 부분 절개에서 최상의 상태로 작동합니다. </li><li> 한 날카로운 microdissection 스프링 가위가 필요합니다. </li><li> 이 좋은 밀고 포셉 필요합니다. </li></ol> 3. 애벌레 수집 <ol><li> GFP 태그 소포 단백질을 표현 아르 제 3 instar의 애벌레를 방황하는 것은 배양 접시에 저장됩니다. </li><li> 애벌레는 모든 음식을 없애 탈이온수에 씻어 수 있습니다. </li></ol> 4. 애벌레의 라이브 해부 <ol><li> 유충은 유리 슬라이드에 절개의 겔 큐브로 전송됩니다. 유충은 해부 버퍼에 포장되어 있습니다. </li><li> 유충은 앞쪽에와 후부가 등의 측면을 가진 두 개의 좋은 핀을 이용하여 pined 있습니다. </li><li> microdissection 가위를 사용하여, 작은 상처는 사후 끝에 근처에있는 정중선에서 이루어집니다. 이 절개의 상처가 앞쪽이을 통해 이루어집니다. 이 핀을 사용하여 측면 가장자리에 자른 표피를 핀. </li><li> 버퍼를 해부 한 방울을 추가합니다. 조심스럽게 포셉과 창자, 내장 지방의 시체를 제거합니다. 이러한 조직의 대부분은 일반적으로 지느러미 절단하는 동안 밖으로 스며 나오게하다. </li><li> 신선한 해부 버퍼로 버퍼를 교체합니다. 유충은 건조한 않을 것입니다 그리고 지속적으로 버퍼를 해부에 있어야합니다. </li><li> 생체내 마커의 MitoTracker 또는 LysoTracker에서 사용 Incubations는 해부 버퍼의 생체내 마커의를 diluting하여,이 시간에 이루어집니다. 생체내 표지에의 부화 후 해부 유충에게 신선한 해부 버퍼를 사용하여 여러 번 (5 빠른 세척) 씻으십시오. </li><li> 교체 후 마지막 세차 syligard 즉시 coverslip에 핀을 밀어. 애벌레는 이제 관찰을위한 준비가되었습니다. </li></ol> 5. 해부 애벌레의 라이브 영상 <ol><li> 현미경 스테이지와 거꾸로 현미경을 사용하여 이미지에 coverslip와 젤 놓습니다. </li><li> 우리는 애벌레 segmental 신경 이내에 이미지 태그를 vesicles로 100x 렌즈를 사용합니다. segmental 신경이 몇 군데되기 전에 복부 신경절의 세포 기관에서 GFP 발현 먼저 평가됩니다. 강력한 GFP의 얼룩이 복부 신경절에 세포 기관에서 관찰하면, 신경은 다음 몇 군데와 평가를 위해 사용됩니다. </li><li> CFP / YFP 또는 RFP / YFP에 대한 필터와 분할보기 소프트웨어 생체내에서 우리가 할 수있는 동시에 이미지를 두 개의 태그 단백질과 듀얼 뷰 시스템을 사용합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1 :. 애벌레 segmental 신경 내에 많은 axonal 트랙에 많은 axonal vesicles을 보여주는 대표 이미지 axonal 쌓일 대표, GFP의 모양을 확인합니다. <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 : 애벌레 segmental 신경 내에 많은 axonal vesicles로 단일 axonal 트랙을 보여주는 대표 이미지.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Drosophila 애벌레 segmental 신경 사이 시냅스 소포 수송의 생체내 이미징에서 axonal 교통의 메커니즘을 연구를위한 강력한 도구입니다. 우리는 이전 반복의 확장은 소포 수송 3 역학에 미치는 영향 명료하게하다 확대 polyQ 반복을 표현 애벌레 신경 내에 전송 역학을 평가하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 이 프로토콜을 사용하는 것은 소포 운동의 속도는 kymograph에 비디오 스트림을 변환하여 결정하실 수 있습니다. 유전학 사용하여 GFP의 소포 운송은 GFP의 표현을 드라이브에 특정 GAL4 드라이버를 사용하여 단일 축삭 내에서 또는 여러 axons 이내 시각하실 수 있습니다. 또한 교통의 역학은 또한 특정 유전자에 대한 변이를 들고 유충에서 볼 수 있습니다. 또한 다른 GFP 변종 (CFP 또는 RFP)로 태그가이 vesicles 동시에 시각하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>미세 해부 가위 1개</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>스프링 가위 &amp;#8211; 날 길이 6mm. 팁 직경 0.125 mm</td></tr><tr><td>포셉 2개</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Fisherbrand 해부용 Micro-Adson 톱니형 팁 포셉</td></tr><tr><td>해부용 핀 한 박스</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Minutien 핀 직경 0.1mm</td></tr></tbody></table>

drosophila 애벌레 segmental axons 이내 시냅틱 vesicles의 생체내 시각화에

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

axonal 수송의 메커니즘을 Elucidating하면 장거리 수송의 결함은 다른 신경 질환에 미치는 영향에 대해 결정에서 매우 중요하다고 표시했습니다. 이 필수 과정에서 결함의 연결 기능 및 개발에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는을 폭로하기 위해 설계되었습니다 해부 프로토콜을 개발했습니다<em&gt; Drosophila</em실시간 axonal 교통을 보려면&gt; 애벌레 segmental 신경. 우리는 허드와 애벌레 segmental 신경의 immunolocalizatin 사용 색스턴 (1996)에 의해 출판 하나에서 라이브 영상이 프로​​토콜을 적응있다. 주의 해부 적절한 버퍼 조건 해부 애벌레의 수명을 최대화를 위해 중요하다. 제대로 완료되면, 해부 유충이 생리 조건 하에서 2~3시간에 대한 강력한 소포 ​​전송을 보여주었다. 우리는 UAS - GAL4 방법을 사용<sup&gt; 1</sup&gt; 표현하는 GFP - 태그의 연결을 다른 GAL4 드라이버를 사용하여 애벌레 segmental 신경에서 하나의 축삭 또는 여러 axons 이내 APP 또는 synaptotagmin의 vesicles 있습니다. 기타 찬란 태그 마커 예를 들어 mitochrondria (MitoTracker) 또는 lysosomes (LysoTracker)는 또한보기 전에 애벌레에 적용할 수 있습니다. GFP - 소포 운동과 입자의 움직임은 별도의 파장을 사용하여 동시에 볼 수 있습니다.

이 프로토콜은의 라이브 절개를 설명<em&gt; Drosophila</em영상의 목적은 미세 소관 트랙에 GFP 태그 axonal vesicles의 움직임에 대해&gt; 애벌레.

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

축삭 수송 메커니즘을 규명하는 것은 장거리 수송의 결함이 서로 다른 ...에 어떠한 영향을 미치는지 결정하는 데 매우 중요하다는 것이 밝혀졌습니다.

알츠하이머병 또는 헌팅턴병과 같은 신경계 질환에서 장거리 축삭 수송의 결함이 존재하는지 연구하고자 합니다. 살아있는 식도 용암에서 수송 소낭의 축삭 수송을 이미징합니다. 여기 궁금한 점이 있습니다.A GFP 태그가 부착된 physical 단백질을 발현하는 세 번째 단계의 별 모양 유충을 겔 큐브 상에서 해부한 후, in vivo 이미징을 위해 현미경으로 옮깁니다. 그 다음 형광 현미경을 사용하여 축삭 내의 sical 수송을 추적합니다. 기존 방법보다 이 기술을 사용할 때의 주요 장점은 시냅스 소포와 유충 축삭의 살아있는 상태의 중단 없는 이동을 시각화할 수 있다는 점입니다.다음의 준비물과 시약이 준비되었는지 확인하여 해부 준비를 합니다. 해부 완충액. 가로 1인치, 세로 1인치, 높이 1cm 크기로 자른 Sill guard 큐브를 유리 슬라이드 위에 배치합니다.초단거리 해부 핀. manum 핀의 날카로운 하단 부분은 해부 시 가장 효과적입니다. 더 긴 핀을 겔에 삽입한 후 돌출된 부분을 잘라내어 적절한 길이를 맞출 수 있습니다.또한 날카로운 미세해부용 스프링 가위 한 쌍과 미세 팁 핀셋 두 세트가 필요합니다. 작은 금속 스파툴라를 사용하여 GFP 태그된 SLE 단백질을 발현하는 방황기 3단계 별 모양 유생을 페트리 접시로 옮기십시오.다음으로, 페트리 접시 속의 유충에 탈이온수를 가하여 모든 먹이를 제거합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 유충을 해부용 겔 큐브로 옮겨 생체 해부를 수행합니다. 핀셋을 이용해 유충 한 마리를 해부용 겔 큐브로 옮기십시오.유리 슬라이드 위에 해부 완충액을 추가하여 슬라이드를 담급니다. 다음으로, 등 쪽이 위로 향하게 하여 유생의 앞끝과 뒤끝을 핀으로 고정합니다. 미세해부 가위를 사용하여 뒤끝 근처의 중앙선에 작은 절개를 냅니다.이 절개 부위에서 전면까지 다시 한번 절개합니다. 두 개의 핀을 사용하여 장과 지방체를 밀어내어 제거합니다. 절개된 큐티클의 가측 가장자리를 실 가드 큐브(sil guard cube)에 고정합니다.피펫을 사용하여 해부 완충액 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 핀셋을 이용해 장과 지방체를 조심스럽게 제거합니다. 킴와이프를 유충의 한쪽에 대어 완충액을 제거하는 동시에, 피펫으로 신선한 해부 완충액을 추가합니다.라바(lava)가 건조해지지 않도록 주의하십시오. 라바 내의 미토콘드리아 또는 리소좀 구조를 표지하려면, 해부 버퍼를 mito tracker 또는 lyo tracker가 포함된 해부 버퍼로 교체하십시오. 해부 큐브를 정사각형의 습윤 챔버에 넣고 알루미늄 호일로 덮으십시오.실온에서 10분 동안 배양합니다. in vivo 마커 배양이 끝나면, 유충 주변의 해부 완충액을 반복적으로 흡수하고 피펫으로 해부 완충액을 더 추가합니다. 남은 마커를 씻어내기 위해 이 과정을 5회 반복합니다.마지막 세척액을 교체한 후, 핀을 S 가드 안으로 완전히 밀어 넣고 유충의 움직임을 방지하기 위해 즉시 커버 슬립을 덮습니다. 이제 유충을 관찰할 준비가 되었습니다. 해부된 유충의 라이브 이미징을 수행하려면, 표지된 소포를 촬영하기 위해 샘플을 도립 현미경의 스테이지 위에 놓으십시오.유충의 분절 신경 내에서. 100배 대물렌즈를 사용하여 이미징을 수행합니다. 복측 신경절 이미지의 세포체에서 강한 GFP 염색이 관찰되는 경우, C-F-P-Y-F-P 또는 R-F-P-Y-F-P 필터가 장착된 듀얼 뷰 시스템과 분할 뷰 소프트웨어를 사용하여 분절 신경 내의 두 가지 인비보(in vivo) 태그 단백질을 동시에 관찰할 수 있습니다.이 타임랩스 시리즈에는 유충의 분절 신경 내 여러 축삭 경로를 따라 이동하는 많은 축삭 소포들이 나타나 있습니다. 축삭 축적물을 나타내는 GFP와 소포들의 양방향 이동에 주목하십시오. 여기서는 유충 분절 신경 내 단일 경로를 따라 이동하는 축삭 소포들의 움직임을 볼 수 있습니다.참고로, 이들 슬라이드의 양방향 이동 속도는 초당 평균 1 µm입니다. 이 영상을 시청한 후에는 GFP가 표지된 소포와 유충 축삭의 in vivo 관찰을 위해 깨끗하게 해부하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

in-vivo-visualization-synaptic-vesicles-within-drosophila-larval

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 공촛점 현미경과 형광 염료를 사용하여 라이브 파리 애벌레의 소설 내부 아웃 조직 준비에 Glia - 신경근육학 시냅스의 구조 기능을 설명했다. 우리는 HRP에 형광 기본 항체 살 신경 터미널로 표시하고, 또한 형광 Dextrans와 perisynaptic 공간을 시각.

라이브를 떠올리 Drosophila</em형광 염료와 함께> Glial - 신경근육학 융티온

Drosophila melanogaster의 애벌레가 애벌레 segmental 신경 이내 axonal 수송의 메커니즘을 조사하기 위해 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 이 절차를 사용하여 다양한 변이를 갖고 제 3 instar의 애벌레는 야생 타입 애벌레 비교할 수 있습니다.

3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비

우리는 개최 준비하는 절차를...

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

이 프로토콜은 그대로의 anesthetization 및 이미징을위한 신뢰할 수있는 방법을...

서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

이 비디오는 형광 염료를 사용하여 채널로돕신 발현 초파리 유충의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 청색광은 채널로돕신을 활성화하여 칼슘 유입과 시냅스 소포 외포작용(synaptic vesicle exocytosis)을 일으킵니다. 염료는 신경세포막에 통합되고 세포내이입 중에 내부화되어 형광이 향상됩니다. 추가적인 청색광 자극은 엑소사이토시스(exocytosis)와 염료 방출을 유도하며, 이는 형광 감소로 나타납니다.

Gingerphila 유충의 시냅스 소포 재활용 및 형광 염료 흡수 분석

출처: Jeong, S. Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴 시각화. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 초파리 배아에서 축삭돌기의 시각화를 보여줍니다. 운동 뉴런의 면역 라벨링, 뉴런 구조를 드러내기 위한 정확한 해부, 미분 간섭 대비 현미경을 통해 축삭 돌기 패턴을 강조하는 상세한 뉴런 구조를 총체적으로 보여줍니다.

Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila (초파리에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴의 시각화)

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

배우세요 Drosophila 애벌레의 생체내 시냅틱 소포 운동을 형광 현미경으로 관찰하는 방법입니다. GFP 표지 단백질을 이용한 축삭 수송 연구에 활용됩니다.

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

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