Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

알츠하이머병 또는 헌팅턴병과 같은 신경계 질환에서 장거리 축삭 수송의 결함이 존재하는지 연구하고자 합니다. 살아있는 식도 용암에서 수송 소낭의 축삭 수송을 이미징합니다. 여기 궁금한 점이 있습니다.

A GFP 태그가 부착된 physical 단백질을 발현하는 세 번째 단계의 별 모양 유충을 겔 큐브 상에서 해부한 후, in vivo 이미징을 위해 현미경으로 옮깁니다. 그 다음 형광 현미경을 사용하여 축삭 내의 sical 수송을 추적합니다. 기존 방법보다 이 기술을 사용할 때의 주요 장점은 시냅스 소포와 유충 축삭의 살아있는 상태의 중단 없는 이동을 시각화할 수 있다는 점입니다.

다음의 준비물과 시약이 준비되었는지 확인하여 해부 준비를 합니다. 해부 완충액. 가로 1인치, 세로 1인치, 높이 1cm 크기로 자른 Sill guard 큐브를 유리 슬라이드 위에 배치합니다.

초단거리 해부 핀. manum 핀의 날카로운 하단 부분은 해부 시 가장 효과적입니다. 더 긴 핀을 겔에 삽입한 후 돌출된 부분을 잘라내어 적절한 길이를 맞출 수 있습니다.

또한 날카로운 미세해부용 스프링 가위 한 쌍과 미세 팁 핀셋 두 세트가 필요합니다. 작은 금속 스파툴라를 사용하여 GFP 태그된 SLE 단백질을 발현하는 방황기 3단계 별 모양 유생을 페트리 접시로 옮기십시오.

다음으로, 페트리 접시 속의 유충에 탈이온수를 가하여 모든 먹이를 제거합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 유충을 해부용 겔 큐브로 옮겨 생체 해부를 수행합니다. 핀셋을 이용해 유충 한 마리를 해부용 겔 큐브로 옮기십시오.

유리 슬라이드 위에 해부 완충액을 추가하여 슬라이드를 담급니다. 다음으로, 등 쪽이 위로 향하게 하여 유생의 앞끝과 뒤끝을 핀으로 고정합니다. 미세해부 가위를 사용하여 뒤끝 근처의 중앙선에 작은 절개를 냅니다.

이 절개 부위에서 전면까지 다시 한번 절개합니다. 두 개의 핀을 사용하여 장과 지방체를 밀어내어 제거합니다. 절개된 큐티클의 가측 가장자리를 실 가드 큐브(sil guard cube)에 고정합니다.

피펫을 사용하여 해부 완충액 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 핀셋을 이용해 장과 지방체를 조심스럽게 제거합니다. 킴와이프를 유충의 한쪽에 대어 완충액을 제거하는 동시에, 피펫으로 신선한 해부 완충액을 추가합니다.

라바(lava)가 건조해지지 않도록 주의하십시오. 라바 내의 미토콘드리아 또는 리소좀 구조를 표지하려면, 해부 버퍼를 mito tracker 또는 lyo tracker가 포함된 해부 버퍼로 교체하십시오. 해부 큐브를 정사각형의 습윤 챔버에 넣고 알루미늄 호일로 덮으십시오.

실온에서 10분 동안 배양합니다. in vivo 마커 배양이 끝나면, 유충 주변의 해부 완충액을 반복적으로 흡수하고 피펫으로 해부 완충액을 더 추가합니다. 남은 마커를 씻어내기 위해 이 과정을 5회 반복합니다.

마지막 세척액을 교체한 후, 핀을 S 가드 안으로 완전히 밀어 넣고 유충의 움직임을 방지하기 위해 즉시 커버 슬립을 덮습니다. 이제 유충을 관찰할 준비가 되었습니다. 해부된 유충의 라이브 이미징을 수행하려면, 표지된 소포를 촬영하기 위해 샘플을 도립 현미경의 스테이지 위에 놓으십시오.

유충의 분절 신경 내에서. 100배 대물렌즈를 사용하여 이미징을 수행합니다. 복측 신경절 이미지의 세포체에서 강한 GFP 염색이 관찰되는 경우, C-F-P-Y-F-P 또는 R-F-P-Y-F-P 필터가 장착된 듀얼 뷰 시스템과 분할 뷰 소프트웨어를 사용하여 분절 신경 내의 두 가지 인비보(in vivo) 태그 단백질을 동시에 관찰할 수 있습니다.

이 타임랩스 시리즈에는 유충의 분절 신경 내 여러 축삭 경로를 따라 이동하는 많은 축삭 소포들이 나타나 있습니다. 축삭 축적물을 나타내는 GFP와 소포들의 양방향 이동에 주목하십시오. 여기서는 유충 분절 신경 내 단일 경로를 따라 이동하는 축삭 소포들의 움직임을 볼 수 있습니다.

참고로, 이들 슬라이드의 양방향 이동 속도는 초당 평균 1 µm입니다. 이 영상을 시청한 후에는 GFP가 표지된 소포와 유충 축삭의 in vivo 관찰을 위해 깨끗하게 해부하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.