의 사출. stephensi의 태아는 말라리아 방지 모기를 생성하는

전 세계적으로 15초마다 한 명의 어린이가 말라리아로 사망하고 있습니다. 이곳 James 연구실에서는 말라리아 원충을 옮길 수 없는 형질전환 모기를 만들기 위한 연구를 진행하고 있습니다. 제 이름은 TIUs이며, 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 분자생물학 및 생화학부 Anthony James 교수 연구실에서 연구하고 있습니다.

오늘은 형질전환 및 비형질전환 모기의 알을 만드는 방법을 보여드리겠습니다. 이는 말라리아 모기가 말라리아 기생충을 옮길 수 없도록 저항성을 갖게 하기 위함입니다. 이제 모기가 알을 낳을 수 있도록 등장성 완충액이 담긴 바이알을 준비했습니다.

이 흡입기를 사용하여 모기를 빨아들여 바이알에 넣겠습니다. 그다음 이 바이알을 30 °C의 인큐베이터 내 컵에 넣고 약 1시간 동안 둡니다. 이제 미세주입 바늘을 꺼내겠습니다.

이것들은 석영으로 만들어진 니들로, 매우 미세한 팁을 사용해야 합니다. 따라서 니들 풀러가 필요합니다. 당사는 Suter Instruments 사의 니들 풀러와 Suter Instruments 사의 니들을 사용합니다.

이제 모기들을 꺼내어, 등장성 완충액에 적신 여과지가 들어 있는 페트리 접시에 알들을 옮기겠습니다. 이는 주입 과정 동안 배아가 건조해지지 않도록 유지하기 위함입니다. 여과지에 적셔진 물의 양이 매우 중요한데, 알들이 물에 떠다니지 않으면서도 마르지 않도록 조절해야 합니다.

이제 배아를 난자 종이에서 등장성 완충액(isotonic buffer)에 적신 또 다른 3mm Watman 종이 위로 옮기겠습니다. 미세주입을 위해 정렬하기 전에 난막(chorion)을 제거하기 위함입니다. 이제 난자의 은색 표면인 난막을 제거하겠습니다.

저는 브러시를 사용하여 이를 털어내는 방식으로 작업을 수행합니다. 여기 위쪽에는 Corian이 여전히 남아 있는 배아가 있으며, 은색으로 빛나는 부분이 보입니다. 아래쪽에 있는 것은 어떤가요?

Corian을 성공적으로 제거했으며, 이 경우 위쪽은 테이프 위에서 미끄러질 가능성이 높고 아래쪽은 고정될 것입니다. 이는 비대칭 측면 작업을 수행할 때 중요한 부분입니다. 이제 배아들을 정렬하겠습니다.

배아의 전단부는 더 굵으며, 이 부분을 오른쪽으로 향하게 배치합니다. 왼쪽에는 더 가느다란 후단부가 위치하며, 이 부위에 배아를 주입하게 됩니다. 배아들이 서로를 지지하여 위치를 유지할 수 있도록 함께 배치합니다.

보통 한 줄에 10개 정도를 함께 배치합니다. 이제 배아들이 한 줄로 정렬되었으며, 이를 커버슬립으로 옮기겠습니다. 커버슬립 위로 옮깁니다.

밀착력을 높이기 위해 가발 테이프를 붙였습니다. 그 다음, 배아가 놓인 필터 페이퍼를 다른 필터 페이퍼로 말린 뒤, 배아를 커버슬립 위에 올리고 오일을 도포하기 전 30초 동안 건조시킵니다. 이제 배아들을 정렬하여 오일 아래에 배치했습니다.

현미경 스테이지 위에서, 미생물 패턴의 이 특수 팁을 사용하여 식용 색소와 혼합된 DNA를 주입하고, 이를 포트 바늘에 주입합니다. 이제 바늘을 채웠으며 이를 마이크로 인젝터에 다시 장착했습니다. 이제 마이크로 주입을 수행할 준비가 되었습니다.

이제 바늘을 이동시켜 초점을 맞춘 후 선명하게 확인합니다. 그 다음, 가중치 바늘을 이동시키고 배아들을 이동시켜 마찬가지로 초점을 맞춥니다. 작업이 완료되면, 바늘이 적절한 위치에 올 때까지 다시 이동시킨 후 배아 쪽으로 이동합니다.

이제 바늘이 오일을 통과하면 흐릿해지므로 다시 조정해야 합니다. 이것이 바로 shark입니다. 정확히, shark tick입니다.

이제 주입을 진행하겠습니다. 바늘로 배아를 살짝 터치한 것을 보셨을 텐데, 이렇게 하면 팁이 깨지면서 배아 내부로 주입될 작은 액적(droplet)이 나오는 것을 확인할 수 있습니다. 여기서 주입한 후 다시 바늘을 뺍니다.

그리고 저는 배아 하나하나를 처리할 때마다 바늘 끝에 작은 액적(droplet)이 맺혀 있는지 매번 확인합니다. 보시다시피, 완벽한 위치를 잡기 위해 각 배아마다 위치를 다시 조정해야 합니다. 지금 이 경우에는 액체가 새어 나오고 있었습니다.

보시는 바와 같이, 오일 상에서 두 번째 주입을 수행할 때 기포가 매우 커지므로 마이크로 인젝터의 압력을 다시 조정해야 합니다. 이제 마이크로 주입 과정이 완료되었으므로, 배아를 현미경에서등장톤 버퍼로 채운 페트리 접시로 옮기겠습니다. 커버 슬립에서 오일을 닦아내고 작은 조각으로 잘라 페트리 접시에 넣겠습니다.

이제 이를 실온에서 오늘 하루 끝날 때까지 이곳에 둘 것입니다. 그 후 곤충 사육실로 옮깁니다. 오늘은 일시적 형질전환 모기를 만들기 위해 AAV-GFP를 주입하는 방법을 보여드렸습니다.

이제 유충들이 모두 부화할 때까지 기다리기만 하면 됩니다. 유충을 성체까지 성장시킨 후 교배를 진행할 것입니다. 그 후 약 3주가 지나면 이들이 Refactor인지 아닌지 스크리닝을 시작할 수 있습니다.