Name: 의 사출. stephensi의 태아는 말라리아 방지 모기를 생성하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 학습하세요 Anopheles stephensi 모기의 미세주사 기법을 통해 말라리아 저항성 유전자를 도입하는 방법을. 이 기술은 아시아 말라리아 매개체를 대상으로 한 유전자 변형 모기 개발에 활용됩니다.

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microinjection 사전에 준비 : <ol><li> 혈액 공급 모기 : 월요일에서 이전 금요일에 수요일 피드 여자에 분사하십시오. 같은 주 월요일에 목요일과 금요일, 피드 여자를 삽입합니다. </li><li> 프로그램 2 isotonic 버퍼 (자료 참조)를 사용하여 석영 바늘을 준비합니다. </li><li> 배아에 대해 &quot;튜브를 만들고 것은&quot;일반 Drosophila 문화 약병입니다. 그것을 다루는 필터 종이 젖은 디스크와 함께 바닥에 젖은 탈지면. </li><li> 권력을 더블 사이드 테이프를 대고 비닐 커버 신청서를 준비합니다. 그것이 커버 슬립의 가장자리에 끝이 너무 커버하는 트림 테이프 이구요. </li><li> 탈수에 대한 오일을 준비합니다. </li><li> 부화를위한 배아를 전송하는 isotonic 버퍼와 페트리 접시를 준비합니다. </li></ol> 강제 부설의 설정 : <ol><li> 흡인기를 이용하여 6-10 혈액 공급의 여자를 수집하고 면화와 isotonic 버퍼와 젖은 여과지로 Drosophila 문화 병을에게 전송할 수 있습니다. </li><li> 모기는 다음 어둠 속에서 insectery 조건에 다시 넣고 1 H 15 분 알을 낳기 위해 사용할 수 있습니다. </li><li> 성인 케이지로 비행하고 태아와 여과지 디스크를 제거하자. </li><li> 계란 라인, 해부 현미경으로 그것을. 훌륭한 페인트 (사블, 아니 0000)로 달걀 한 움큼를 수집하고 isotonic 버퍼로 적셔 3MM 왓먼 용지 준비 광장에 전송할 수 있습니다. 모든 시간은 서부 유럽 표준시 종이 보관하십시오. 계란이 desiccated 내버려하지 마십시오. 브러시로 exochorion 제거 그것은 더 나은 테이프에 달걀을 붙어줍니다. </li><li> 좋은 forcep 번호 5 벌금 페인트를 사용하여 어두운 회색 배아를 선택하고 isotonic 버퍼와 젖은 3MM 왓먼의 광장에 일렬로 배열. 20-30 배아에서 줄을. 주사는 후부 기둥에 갈 수있는 것처럼 모든 배아는 동일한 방향에 있어야합니다. 배아의 앞쪽에 끝이 뒷부분보다 약간 넓은 있습니다. 그런 다음, 3MM 왓먼 종이의 줄무늬를 사용하면, 계란은, 계란 라인의 양쪽에 하드 눌러 계란을 만질 의해 줄지어있는 필터를 건조. </li><li> 계란을 전송, 이중 양면 테이프 (의학)이있는 슬라이드를 반전하고, 부드럽게 달걀에 대한 누르십시오. 계란의 뒷부분 끝 이중 양면 테이프의 가장자리에 아주 가까이해야합니다. 그것이 그들이 스틱되지 않습니다 너무 젖어있는 경우 용지의 촉촉한이 중요합니다. 나는 5-10초에서 태아의 탈수를하지만, 탈수 시간은 microinjection 방에 습기와 온도의 따라 달라집니다. </li><li> 너무 조금 및 배아는 부화하지 않습니다 건조 계란은 중요합니다. 탈수의 DNA없이 배아로하지 않을 것입니다. </li><li> 더 탈수를 방지하기 위해 할로 카본 오일 desiccated 배아를 커버. </li></ol> 배아의 Microinjection : 좋은 주입의 가장 중요한 부분은 (주 참조) 바늘의 품질입니다. <ol><li> microloader을 (Eppendorf # 5242 956.003)를 사용하여 주입하는 DNA 솔루션 바늘을 입력합니다. 아주 작은 주사 soliution은 1-2 ML이 필요합니다. </li><li> 사출 시간과 압력을 제어하는​​ Eppendorf Transjector,뿐만 아니라 backpressure에 바늘을 연결합니다. Microinjection은 X 10 배율과 micromanipulator (Leica)에 이동 무대 (Leica)와 현미경을 사용하여 수행됩니다. 필요한 경우, 제기 현미경 스테이지는 4-5 현미경 슬라이드를 스태킹하여 준비 수 있습니다. 제기 무대에 배아를 가지고 커버 전표를 놓습니다. 배아는 150 °의 각도로 주입되며 보급률은 사후 극에서해야합니다. 주사, 그 바늘이 고정 유지하고 현미경의 단계로 이동합니다. 바늘이 새로운하면 끝은 봉인과 일반적으로 첫 번째 주입에서 봐야합니다. 나는 항상 각 분사 사이에 오일로 DNA의 작은 비말을 추방하는 데 필요한 압력을 작동합니다. </li><li> 나는 0.2 분사 시간을 설정 - 0.9 초 1000 고전력 증폭기를 바늘이 새로운 경우에. 작은 비말이 오일로 바늘에서 나오는 볼 때까지 나는 압력 및 시간을 달라집니다. backpressure 100 주위를 설정해야합니다. 바늘 끝이 착용지면서, 사출 압력은 사출 볼륨을 낮은 (고전력 증폭기 약 300) 유지 줄일 수있다. 이 후, 바늘 끝이 너무 큽니다 및 배아의 대부분을 죽이고있다. </li><li> 주입 후, 티슈로 기름을 제거하고 배아와 isotonic 버퍼와 배양 접시에있는 장소로 슬라이드를 커버. insectory에서 요리를 삽입하여 배아는 부화가있을 때까지 그들을 두십시오. 그들은 2~6일 후에 부화하기 시작합니다. 지상 물고기 음식 핀치와 증류수에 애벌레를 전송합니다. </li></ol> 노트 주사에 대한 DNA : 주사에 대한 플라스미드 DNA 솔루션은 EndoFree 플라스미드 키트를 사용하여 격리되었다.플라스미드 구축 및 오른쪽 농도 함께 도우미 플라스미드 믹스, 이소프로판올 함께 시켰던. 펠렛은 사출 버퍼 resuspending하기 전에 70 % 에탄올로 씻은했다. 전에 주입, Millex - GV 칼럼을 사용하여 청소 DNA. Izotonic 버퍼 : <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 1.68 M NaCl - 88.3 ML 1.68 M NaCl - 2.9 m 1 M은 -10.7 ML을 Hepes 1.12 M CaCl 2-2.2 ML DH 2 O - 896 ML </td><td> 또는 </td><td> 5 M NaCl - 29.67 ML 1 M KCl - 4.87 ML 1 M의 Hepes - 10.7 ML 1.12 M CaCl 2-2.2 ML DH 2 O - 952.56 ML </td></tr></tbody></table> 산도 7.2 조정

<table><tbody><tr><td>주사용 쿼츠 니들</td><td></td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>O.D. 1.0 mm, I.D. 0.70, 길이 10 cm이며, 마이크로피펫 풀러를 사용하여 모세관 튜브를 약 100-300 mm 샤프트와 3-8 um의 미세 팁으로 인발하여 준비한다.</td></tr><tr><td>쿼츠 풀러</td><td>도구</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td>설정: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141</td></tr><tr><td>EndoFree 플라스미드 키트</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV 컬럼</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>DNA 정제용</td></tr><tr><td>Construct DNA</td><td></td><td></td><td></td><td>0.5 mg/ml </td></tr><tr><td>헬퍼 플라스미드</td><td></td><td></td><td></td><td>0.3 mg/ml </td></tr><tr><td>주입 용액</td><td>완충액</td><td></td><td></td><td>1x 용액: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, pH 6.8</td></tr><tr><td>등장성 완충액</td><td></td><td></td><td></td><td>프로토콜 섹션의 레시피 참조</td></tr><tr><td>건조 오일</td><td></td><td></td><td></td><td>Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). 잘 혼합한다. 미세주입 전에 미리 준비한다.</td></tr><tr><td>혈액</td><td></td><td></td><td></td><td>모기 급여용</td></tr><tr><td>Anopheles stephensi</td><td>동물</td><td></td><td></td><td>모기, 수컷 및 암컷.</td></tr><tr><td>초파리 배양 바이알</td><td></td><td></td><td></td><td>산란용</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td></td><td></td><td></td><td>등장성 완충액 포함, 배아 부화용</td></tr><tr><td>세밀 붓</td><td></td><td></td><td></td><td>Sable # 0000</td></tr><tr><td>3MM Whatman 종이</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포셉 #5</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더</td><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>트랜스젝터</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>이동식 스테이지 및 마이크로매니퓰레이터 포함, 10x 배율로 설정</td></tr></tbody></table>

의 사출. stephensi의 태아는 말라리아 방지 모기를 생성하는

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

모기의 genomes에 외인성 유전자의 도입은 관심의 특정 수종에 맞는 microinjection 기술을 필요로합니다. 이 비디오 프로토콜 변형 모기의 생성을위한 아노 펠 레스 stephensi의 배아에 DNA 구조를 microinject하는 제임스 실험실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. , microinjection의 바늘을 준비하는 배아를 수집하고 준비하고 microinjection을 수행하기위한 기술은 그림입니다.

아노 펠 레스 stephensi 모기가 말라리아 거주 인도 및 아시아 벡터입니다. 이 동영상은 모기에 말라리아에 대한 저항력을 부여합니다 transgenes이 종 microinjections을 수행하는 기법을 보여줍니다. 대부분이 동영상에서 보여주는 방법의 다른 모기 종의 microinjection 기술에 적용됩니다.

모기의 게놈에 외래 유전자를 도입하려면 대상 종의 특성에 맞게 조정된 미세주입 기술이 필요합니다. 이...

전 세계적으로 15초마다 한 명의 어린이가 말라리아로 사망하고 있습니다. 이곳 James 연구실에서는 말라리아 원충을 옮길 수 없는 형질전환 모기를 만들기 위한 연구를 진행하고 있습니다. 제 이름은 TIUs이며, 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 분자생물학 및 생화학부 Anthony James 교수 연구실에서 연구하고 있습니다.오늘은 형질전환 및 비형질전환 모기의 알을 만드는 방법을 보여드리겠습니다. 이는 말라리아 모기가 말라리아 기생충을 옮길 수 없도록 저항성을 갖게 하기 위함입니다. 이제 모기가 알을 낳을 수 있도록 등장성 완충액이 담긴 바이알을 준비했습니다.이 흡입기를 사용하여 모기를 빨아들여 바이알에 넣겠습니다. 그다음 이 바이알을 30 °C의 인큐베이터 내 컵에 넣고 약 1시간 동안 둡니다. 이제 미세주입 바늘을 꺼내겠습니다.이것들은 석영으로 만들어진 니들로, 매우 미세한 팁을 사용해야 합니다. 따라서 니들 풀러가 필요합니다. 당사는 Suter Instruments 사의 니들 풀러와 Suter Instruments 사의 니들을 사용합니다.이제 모기들을 꺼내어, 등장성 완충액에 적신 여과지가 들어 있는 페트리 접시에 알들을 옮기겠습니다. 이는 주입 과정 동안 배아가 건조해지지 않도록 유지하기 위함입니다. 여과지에 적셔진 물의 양이 매우 중요한데, 알들이 물에 떠다니지 않으면서도 마르지 않도록 조절해야 합니다.이제 배아를 난자 종이에서 등장성 완충액(isotonic buffer)에 적신 또 다른 3mm Watman 종이 위로 옮기겠습니다. 미세주입을 위해 정렬하기 전에 난막(chorion)을 제거하기 위함입니다. 이제 난자의 은색 표면인 난막을 제거하겠습니다.저는 브러시를 사용하여 이를 털어내는 방식으로 작업을 수행합니다. 여기 위쪽에는 Corian이 여전히 남아 있는 배아가 있으며, 은색으로 빛나는 부분이 보입니다. 아래쪽에 있는 것은 어떤가요?Corian을 성공적으로 제거했으며, 이 경우 위쪽은 테이프 위에서 미끄러질 가능성이 높고 아래쪽은 고정될 것입니다. 이는 비대칭 측면 작업을 수행할 때 중요한 부분입니다. 이제 배아들을 정렬하겠습니다.배아의 전단부는 더 굵으며, 이 부분을 오른쪽으로 향하게 배치합니다. 왼쪽에는 더 가느다란 후단부가 위치하며, 이 부위에 배아를 주입하게 됩니다. 배아들이 서로를 지지하여 위치를 유지할 수 있도록 함께 배치합니다.보통 한 줄에 10개 정도를 함께 배치합니다. 이제 배아들이 한 줄로 정렬되었으며, 이를 커버슬립으로 옮기겠습니다. 커버슬립 위로 옮깁니다.밀착력을 높이기 위해 가발 테이프를 붙였습니다. 그 다음, 배아가 놓인 필터 페이퍼를 다른 필터 페이퍼로 말린 뒤, 배아를 커버슬립 위에 올리고 오일을 도포하기 전 30초 동안 건조시킵니다. 이제 배아들을 정렬하여 오일 아래에 배치했습니다.현미경 스테이지 위에서, 미생물 패턴의 이 특수 팁을 사용하여 식용 색소와 혼합된 DNA를 주입하고, 이를 포트 바늘에 주입합니다. 이제 바늘을 채웠으며 이를 마이크로 인젝터에 다시 장착했습니다. 이제 마이크로 주입을 수행할 준비가 되었습니다.이제 바늘을 이동시켜 초점을 맞춘 후 선명하게 확인합니다. 그 다음, 가중치 바늘을 이동시키고 배아들을 이동시켜 마찬가지로 초점을 맞춥니다. 작업이 완료되면, 바늘이 적절한 위치에 올 때까지 다시 이동시킨 후 배아 쪽으로 이동합니다.이제 바늘이 오일을 통과하면 흐릿해지므로 다시 조정해야 합니다. 이것이 바로 shark입니다. 정확히, shark tick입니다.이제 주입을 진행하겠습니다. 바늘로 배아를 살짝 터치한 것을 보셨을 텐데, 이렇게 하면 팁이 깨지면서 배아 내부로 주입될 작은 액적(droplet)이 나오는 것을 확인할 수 있습니다. 여기서 주입한 후 다시 바늘을 뺍니다.그리고 저는 배아 하나하나를 처리할 때마다 바늘 끝에 작은 액적(droplet)이 맺혀 있는지 매번 확인합니다. 보시다시피, 완벽한 위치를 잡기 위해 각 배아마다 위치를 다시 조정해야 합니다. 지금 이 경우에는 액체가 새어 나오고 있었습니다.보시는 바와 같이, 오일 상에서 두 번째 주입을 수행할 때 기포가 매우 커지므로 마이크로 인젝터의 압력을 다시 조정해야 합니다. 이제 마이크로 주입 과정이 완료되었으므로, 배아를 현미경에서등장톤 버퍼로 채운 페트리 접시로 옮기겠습니다. 커버 슬립에서 오일을 닦아내고 작은 조각으로 잘라 페트리 접시에 넣겠습니다.이제 이를 실온에서 오늘 하루 끝날 때까지 이곳에 둘 것입니다. 그 후 곤충 사육실로 옮깁니다. 오늘은 일시적 형질전환 모기를 만들기 위해 AAV-GFP를 주입하는 방법을 보여드렸습니다.이제 유충들이 모두 부화할 때까지 기다리기만 하면 됩니다. 유충을 성체까지 성장시킨 후 교배를 진행할 것입니다. 그 후 약 3주가 지나면 이들이 Refactor인지 아닌지 스크리닝을 시작할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

역방향 유전자 접근 방법은 모기에 벡터 병원균하는 유전자 underly 저항을 결정하는 매우 유용하게 입증했습니다. 이 비디오 프로토콜은 뎅그열 바이러스를 항구 여성 A. aegypti 모기로 dsRNA를 주입하기 위해 제임스 연구실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. , 주사 바늘을 보정 사출 설정을 조작하고, 흉부에 dsRNA를 주입에 대한 기술은 그림이다.

여성 A. aegypti 모기에의 dsRNA의 분사

이 비디오에서는 Nijole Jasinskiene는 뎅그열 발열에 대한 벡터 아르 유전자 변형 Aedes aegypti 모기를 생성하기 위해 사용된 방법을 보여줍니다. 정확하게, microinjection의 바늘을 준비하는 배아를 d​​essicating, 그리고 microinjection을 수행하기위한 기술은 증명됩니다.

트렌스 제닉 모기를 구하는 A. aegypti의 태아의 Microinjection

이 인터뷰에서, 조지는 Plasmodium falciparum Dimo​​poulos 및 뎅그열 바이러스 감염을 방지하기 위해 모기에 의해 사용되는 생리적 메커니즘에 초점을 맞추고 있습니다. 설명이 방법은 주요 내화물 유전자에 대해 제공됩니다, 벡터 병원균에 대한 저항력을 부여하는 그 유전자는, 모기에 식별 방법과이 지식은 말라리아 기생충이나 뎅그열 바이러스를 가지고 수없는 유전자 변형 모기를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

더 나은 모스키토 구축 : A. gambiae 및 A. aegypti 모기에 말라리아와 뎅그열 발열 저항을 사용 유전자를 확인

쥐 말라리아 기생충의 유전자 십자가는 모기에 두 유전자 별개의 기생충을 먹이에 의해 수행됩니다. 재조합 자손은 모기가 감염된 쥐를 물어 수 있도록 후 마우스 혈액에서 복제됩니다. 이 비디오의 유전자 십자가를 생산하는 방법을...

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

이 비디오에서는 마이크로주입을 통해 Anopheles 배아에서 phiC31 매개 부위 특이적 전이유전자 통합을 시연합니다. 이 방법은 연구 및 산업 응용을 위해 원하는 유전자를 숙주 시스템에 도입하는 데 도움이 됩니다.

phiC31-Integrase-Mediated Site-Directed Transgene Integration: Anopheles 벡터에 부위 특이적 전이유전자 통합을 위한 미세주입 기술

이 비디오에서는 배아 미세주입 기술을 통해 Anopheles gambiae 모기의 배아에 유전자 드라이브 구조를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 통해 상동 재조합을 통해 전달된 DNA 구조를 생식세포 세포에 통합하여 형질전환된 모기 개체군을 생성할 수 있습니다.

모기 배아 미세주입: 생식세포 돌연변이를 생성하기 위해 Anopheles gambiae의 배아 난황에 외인성 DNA를 전달하는 기술

CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

이 프로토콜은 φC31 시스템을 사용하여 Anopheles 말라리아 모기의 게놈에서 사이트 지향적 인 수정을 달성하는 방법을 설명합니다. 설명된 수정은 attP 베어링 도킹 라인의 게놈에 있는 형질전환 카세트의 통합 그리고 교환둘 다 포함됩니다.

말라리아의 아노필스 벡터에서 사이트 지향 φC31 중재 통합 및 카세트 교환

미세 주입 기술은 모기의 게놈에 외인성 유전자를 소개하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 제임스 실험실에서 DNA 구조를 Anopheles 감비아아에 미세 주입하여 변형된 모기를 생성하는 방법을 설명합니다.

아노펠레 감비아에 배아를 위한 미세 주입 방법

말라리아는 감염된 모기에 의한 Plasmodium의 sporozoite 단계 접종을 통해 전염됩니다. 형질전환 플라스모디움 은 말라리아의 생물학을 더 잘 이해할 수 있게 해주었고 말라리아 백신 개발 노력에 직접적으로 기여했습니다. 여기에서는 형질전환 Plasmodium berghei sporozoites를 생성하는 간소화된 방법론을 설명합니다.

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여기에서는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 모기 A. aegypti 에서 배아 미세주입을 통한 게놈 편집을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR-Cas9을 이용한 황열병 모기 이집트숲모기(Mosquito Aedes aegypti )의 게놈 편집

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