Name: 셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 배우세요 블루 네이티브 PAGE를 이용하여 세포 용액에서 다단백질 복합체를 분석하는 방법을. 이 기술은 단백질 상호작용을 보존하며 멤브레인 수용체 구성 연구에 활용됩니다.

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우리는 마이클 Reth, 헤르만 Schägger와 마가리타 과학 지원 카마초 - Carvajal 감사합니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)에서 BIOSS하여 Bundesministerium fuer Bildung 및 Forschung (BMBF)에서 FO​​RSYS에 의해 재정 지원하고, 독일 연방 및 주 정부의 우수 이니셔티브 (GSC - 4, Spemann 대학원에서 일부 지원이 ).

<ol><li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer%3A+identification+of+three+dimer-specific+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li>
<li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li>
<li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+%28NAMOS-assay%29+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li>
<li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

본 연구에서는, 우리는 BN - PAGE에 의해 MPCs의 분석을 설명합니다. 2D 접근이 기본 조건 첫째 별도 MPCs하는 데 사용됩니다, 그리고 추가로 두 번째 차원 SDS - PAGE하여 개별 구성 요소로 그들을 나눌 수 있습니다. 샘플은 세포 lysates의 준비가되어 있습니다. 많은 MPCs의 solubilization 들어, 적절한 세제는 단백질 단지의 구조를 유지하는, 필요합니다. 여기, 우리는 0.1 % 트리톤 X - 100을 사용합니다. 그러나, 최적의 세제와 적당한 농도는 모든 MPC에 대해 경험적으로 결정해야합니다. 의 경우에는 트리톤 X - 100, 예를 들면, 그것은 낮은 세제 농도가 F 1 dimeric 양식의 식별을 허용되는 것으로보고되었습니다 F 0 - ATPase 복합 (아놀드, 파이퍼 외. 1998). 높은 트리톤 X - 100 농도는하지만, 이합체의 분리와 monomeric F 1 F 0 - ATPase 복합 해당 증가로 이어집니다. 높은 농도 또는 다른 세제의 사용가 digitonin 결과를 불리는 반면, 이것은 과거의 연구 중 하나와 라인에, 우리는 Brij 96 낮은 농도로 추출하면 multivalent T - 세포 수용체 복합 (TCR)가 보존는 것을 보여주고 있었다 monomeric TCR의 추출 (Schamel, Arechaga 외. 2005). 테스트할 수 있습니다 일반적으로 사용되는 세제는 digitonin (0.5-1 %), 트리톤 X - 100 (0.1-0.5 %), Brij 96 (0.1-0.5 %), 또는 dodecylmaltoside을 (0.1-0.5 %) 등이 있습니다. 이 시약은 MPC의 안정성을 위해 최선이 될 경향이 nonionic 세제입니다. SDS와 다른 강한 세제과 접촉이 (카마초 - Carvajal, Wollscheid 외. 2004) 피해야한다고 알고 있습니다. lysates의 투석은 BN - 젤의 MPC 분리 (. 카마초 - Carvajal, Wollscheid 외 2004) 달성하는 데 필요한, (Heiss, Junkes 외 2005.). 그것은 소금 농도 또는 낮은 분자량의 불순물의 제거의 조정은 높은 해상도를 위해 중요 것 같습니다. 또한 immunopurified 나중에 항체에서 eluted되었습니다 막 준비와 MPCs이 (스와미, Siegers 외. 2006) BN - PAGE에 적합한 것을 주목할만한 것입니다. 두 경우 모두에서, 샘플은 멤브레인 용해 또는 용출이 BN - 용해 버퍼에서 실시하는 경우, BN - PAGE 분리에 대한 dialyzed 될 필요가 없습니다. BN - PAGE로 단백질 분리, 염료 쿠매시 파란색 단백질 unspecifically 바인딩과 부정 청구와 ​​함께 그들을 포함하는, 필요합니다. 따라서, 쿠매시 파란색 중립 PH (Schägger 및 본 Jagow 1991)에서 음극쪽으로 단백질의 전기 영 동적 이동성을 가능하게, (Schägger, 크래머 외 1994.). 또한, 쿠매시 파란색 전기 영동하는 동안 쌓아 겔의 단백질 집합을 방지합니다. BN - PAGE 들어, 쿠매시 G250은 쿠매시 청색 R250이나 콜로이드 쿠매시 블루스 대신 사용할 수 있습니다. BN - 젤을 실행하기 전에, 그것은 젤의 비율은 관심의 MPC의 예상 크기에 맞는 것을 보장하기 위해 필요합니다. 다양한 그라디언트와 적절한 버퍼 Invitrogen (NativePAGE Novex BIS - 트리스 젤 시스템)에서 상업적으로 사용할 수로 BN - 젤을 프리 캐스트. 그러나 BN - 젤 또한 persistaltic 펌프와 함께 그라디언트 믹서를 사용하여 준비하실 수 있습니다. 손상 그라데이션을 보장하기 위해 액체가 쏟아져과 거품을 피해야한다 동안 끊임없이 유동한다. 과부하가 전기 과정 중에 단백질 침전으로 이어질 수 있기 때문에 우리는 겔에 다른 샘플 dilutions의 로딩을 권장합니다. 또한, BN - 젤은 4 실행되어야 ° C 단백질 저하를 방지하고 MPCs 그대로 유지합니다. MPCs의 BN - PAGE, 시각화가 쿠매시 빛나는 푸른 얼룩, 실버 얼룩이나 immunoblotting하여 얻을 수있다 후에. 단백질 밴드 대량 분석계 (카마초 - Carvajal, Wollscheid 외. 2004)에 의해 더 분석에 적합합니다 쿠매시 또는 실버 얼룩의 시각. immunoblotting의 경우 관심의 MPCs에 대한 최적의 전송 상태는 경험적으로 결정해야합니다. 쿠매시 블루도 BN - 젤의 모래 바닥 동안 전송되는 점에 유의하십시오. 막이 파란 색깔을 발휘합니다 반면 따라서, 젤은 성공적인 전송 후에 무색됩니다. 또한, SDS - PAGE 후 검색을 위해 일하는 게 아니 모든 기본 항체가, BN - PAGE에 immunoblotting에 적용할 수 있다고 언급하는 것이 중요합니다. 그것은 그들의 에피토프이 단백질의 원래 형태에 숨겨져 있기 때문에 항체가 관심의 MPC를 인식하지 않는 것이 발생할 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해서는 1X SDS 샘플 버퍼에 곧 젤 끓는 사전 전송 BN - 겔 내에서 단백질을 변성 수 있습니다. 우리의 예제에서는, 우리는 단백질 밴드의 검출에 직접 BN - 젤 적용되지 않았다. 대신, 우리는 추가로 두 번째 dimensi하여 BN - PAGE로 구분 lysate를 나누어SDS - PAGE에. 두 번째 차원 SDS - 겔에서 monomeric 단백질은 두 번째 차원 (카마초 - Carvajal, Wollscheid 외. 2004)의 첫 번째와 선형 겔에서 그라디언트 젤로 인해 쌍곡선 대각선 이내에 마이 그 레이션. 그들이 쌍곡선 대각선 아래화된되기 때문에 이것은, MPCs의 쉽게 확인하실 수 있습니다. 한 별개의 MPC의 하위 구성 요소는 두 번째 차원 SDS - PAGE의 수직선에서 구분됩니다. 여러 dinstinct의 MPCs의 성분 구성 요소는 MPC의 크기에 따라 수평선에서 확인할 수 있습니다. 그러나, 하나의 수직선에 나타나는 여러 가지 단백질의 명소도 BN - PAGE의 동일한 위치에서 마이 그 레이션 개별 단지의 일부가 될 수 있다고 간주되어야한다. 그들은 같은 MPC에 나타날 수있는 마지막 증거는 항체 기반 겔 변화 분석에 의해 얻을 수 있습니다. 이 분석에서는 셀룰러 lysate 전에 BN - PAGE로 확인 명소 중 하나에 의해 대표되는 단백질에 대한 항체와 함께 incubated입니다. 첫 번째 차원 높은 분자 질량으로이 단백질을 포함하는 모든 MPCs의 변화이 발생합니다. 이러한 MPCs의 일부 다른 단백질이 복잡한 특정 변화를 받아야하므로 두 번째 차원 SDS - 겔에서 식별하는 쉬운 것입니다. 뿐만 아니라 MPCs의 구성은 BN - PAGE로 분석뿐만 아니라 자신의 stoichiometry의 결정은 (Schamel 및 Reth 2000) 수도 수 있으며 (Schamel 2001), (스와미, Minguet 외 2007.). 이를 위해 NAMOS 분석 (기본 항체 기반 이동성 교대 분석)을 수행할 수 있습니다. 항체 기반 겔 변화 분석에서와 마찬가지로, 세포 lysates은 단클론 subunit 특정 항체와 incubated 있습니다. 이것은 MPCs의 stoichiometry에있는 변화의 범위에서 추론을 허용 BN - 젤에서 전기 immunoshifts의 유도에 연결 conlusion에서 BN - PAGE은 MPCs의 식별과 크기, 구성뿐만 아니라, 상대 풍요의 결정에 적합합니다. NAMOS 분석으로 수행, 그것은 또한 특정 MPC의 stoichiometry을 결정할 수있는 가능성을 제공합니다. 의 일반적인 적용을 감안할 때,이 기법은 MPCs의 특성 (. 데커, 뮐러 외 1996)에 대한 매우 유용한 도구입니다, (위티그 및 Schagger 2008), (바그너, Rehling 외 2009)., (위티그 및 Schägger 2009) .

셀룰러 lysates에서 multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 polyacrylamide 젤 전기 영동 (bn - page)

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

대부분의 단백질이 다른 단백질과 기능이나 규제 단지 (살리, Glaeser 외. 2003)에서 찾을 수 있으므로 Multiprotein의 단지 (MPCs)은 세포 신호 전달에 중요한 역할을한다. 따라서, 단백질 - 단백질 상호 작용 네트워크의 연구는 단백질 기능과 규정의 통합 이해를 얻을 수 MPCs의 세부 특성이 필요합니다. 식별 및 분석을 위해, MPCs는 기본 조건 구분해야합니다. 이 비디오에서는, 우리는 푸른 원시의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (BN - PAGE)에 의해 MPCs의 분석을 설명합니다. BN - PAGE은 젤 여과 또는 자당 밀도 ultracentrifugation에 의해 제공되는보다 높은 해상도와 고유의 형태에 MPCs의 분리를 허용하고, MPC 크기, 구성, 그리고 상대적으로 풍부 (Schägger 및 본 Jagow 1991)를 결정하는 것이 유용합니다 기술입니다 ; (Schägger, 크래머 외 1994.). 이 방법으로 단백질들은 유체 크기와 polyacrylamide의 매트릭스에 형태에 따라 구분됩니다. 여기, 우리는 lysate 투석은 BN - PAGE 이러한 생물 학적 샘플에 적용을하는 중요한 단계입니다 지적, 전체 세포 lysates의 MPCs의 분석을 보여줍니다. 첫째 차원 BN -와 두 번째 차원 SDS - PAGE의 조합을 사용하여, 우리는 BN - PAGE로 구분 MPCs이 더욱 SDS - PAGE에 의해 그들의 개인적인 성분으로 세분화 될 수 보여줍니다. 겔 분리시 MPC 구성 요소의 시각화 표준 immunoblotting에 의해 수행됩니다. BN - PAGE에 의해 MPC 분석을위한 예를 들어, 우리는 잘 특징 진핵세포 19S, 20 대, 그리고 26S proteasomes를 선택했습니다.

이 비디오에서는, 우리는 푸른 원시의 polyacrylamide 겔 전기 영동 (BN - PAGE)에 의해 multiprotein의 단지 (MPCs)의 특성을 설명합니다. 첫 번째 차원에서 dialyzed 세포 lysates은 개별 MPCs을 식별할 BN - PAGE로 구분됩니다. 두 번째 차원 SDS - PAGE에 관심 MPCs은 더욱 immunoblotting하여 성분을 분석하기 위해 세분화됩니다.

셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

다단백질 복합체(Multiprotein complexes, MPCs)는 대부분의 단백질이 다른 단백질과 함께 기능적 또는 조절적 복합체를 형성하고 있기 때문에 세포 신호 전달에서 매우 중요한 역할을 합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis(BN-PAGE)를 사용하여 세포 용해물로부터 MultiPro 복합체를 특성화하는 것입니다. BN-PAGE는 SDS-PAGE와 달리 천연 상태(native conditions)에서 단백질을 분리할 수 있어 단백질 간의 상호작용을 보존할 수 있습니다. 이를 위해 먼저 세포 용해물을 투석하여 과잉 염을 제거함으로써, 두 번째 단계인 BN-PAGE 분리에 적합한 샘플 상태로 만듭니다. 이후 용해물을 1차원 BN-PAGE에 적용하면, 천연 상태의 단백질 복합체들이 크기와 모양에 따라 분리됩니다.다음으로, 2차원 분석을 수행합니다. 복합체를 각각의 개별 성분으로 분리하기 위해 변성 SDS page를 실시합니다. 단백질은 silver 염색, coumasie 염색 또는 western blotting을 통해 시각화할 수 있습니다.다음 시연에서는 분리된 단백질을 은 염색(silver stain)으로 검출하였으나, 실제로는 웨스턴 블로팅(western blotting)이 사용될 것입니다. 안녕하세요, 저는 독일 프라이부르크의 막스 플랑크 면역생물학 연구소 분자면역학과의 볼프강 샤멜(Wolfgang Sharmel) 연구실 소속 브리타 블룸(Brita Bloom)입니다. 안녕하세요, 디나 피알라(Dina Fiala)입니다.저 또한 Sham 연구실 소속입니다. 오늘은 세포 용해물로부터 MultiPro 복합체를 분석하는 절차를 보여드리겠습니다. 저희 연구실에서는 다중 서브유닛 막 수용체의 조성을 연구하기 위해 이 절차를 사용하고 있습니다.하지만 이번 영상에서는 tic 프로테아좀을 예시로 사용하겠습니다. 그럼 시작하겠습니다. 이 절차를 시작하기 전에, 서면 프로토콜에 설명된 대로 모든 완충액을 준비하여 4°C로 보관하십시오.1,000만 개의 HEC 2 9 3 세포를 수확하고, 4°C에서 350 ×g로 5분 동안 원심분리하여 세포 침전물을 형성합니다. 그 다음, 1 mL의 ice cold PBS로 세포 침전물을 세척하고 다시 원심분리하여 세척된 세포를 침전시킵니다. 이 세척 과정을 2회 반복한 후, 세척된 세포 침전물을 250 µL의 ice에 재현탁합니다.Cold blue, native lysis 버퍼를 넣고 현탁액을 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 불용성 물질을 제거하기 위해 생세포를 4°C에서 13,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 그동안 파스퇴르 피펫의 가열된 넓은 쪽 끝을 사용하여 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브의 캡에 구멍을 뚫습니다.그 다음 튜브를 얼음 위에 놓아 4 °C까지 냉각합니다. 원심분리가 완료되면, 투석을 통한 염 제거를 위해 용해물을 튜브로 옮깁니다. 열려 있는 튜브 상단에 10 kilodalton 차단 투석막을 배치합니다.캡을 닫고 밖으로 튀어나온 여분의 투석막을 가위로 잘라냅니다. 그런 다음 캡의 측면을 파라필름으로 조심스럽게 밀봉합니다. 밀봉이 완료되면 튜브를 뒤집어 50 mL 코니컬 튜브에 거꾸로 넣습니다. 샘플을 가능한 최저 속도로 10초 동안 원심분리합니다.세포 배양용 원심분리기에서, 샘플 100 µL당 적어도 10 mL의 blue native 투석 완충액을 사용하여 차가운 blue native 투석 완충액과 마그네틱 스터러가 들어 있는 100 mL 비커를 준비합니다. 그다음 핀셋을 사용하여 원뿔형 튜브에서 거꾸로 세워진 튜브를 꺼냅니다. 이때 튜브가 똑바로 세워지지 않도록 주의하십시오.비커 내부에서 튜브를 테이프로 거꾸로 고정한 후, 캡 아래 구멍에서 기포를 제거합니다. 굽은 파스퇴르 피펫을 사용하여 마그네틱 교반기를 켜고, 투석을 위해 샘플을 저온실에서 6시간 또는 밤새 방치합니다. 주기적으로 샘플을 확인하여 교반으로 인해 투석 막에 기포가 생성되지 않는지 확인하십시오.배양 후, 투석된 세포 용해물을 냉각된 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 겔 구배 로딩 전까지 얼음 위에 둡니다. 겔 제작은 구배 믹서를 사용하여 실온에서 수행합니다. 구배 믹서를 교반기 위에 놓고 유연한 튜브 조각에 연결합니다.밸브를 사용하여 그라디언트 믹서의 채널을 닫고 클램프로 튜브를 고정합니다. 튜브와 연결된 실린더 안에 마그네틱 스터러를 넣습니다. 다음으로, 유연한 튜브를 연동 펌프에 끼우고 그 끝에 주사 바늘을 부착합니다.그 다음, 겔 장치 상단의 두 유리판 사이에 니들을 배치합니다. 분리 겔의 부피와 총 부피가 동일하도록 4% 및 15% 분리 겔 용액을 준비합니다. 직전에 PS와 TM me를 추가합니다.겔 용액을 그래디언트 믹서의 해당 실린더에 붓습니다. 그런 다음 전원을 켜고 밸브를 엽니다. 왼쪽 실린더 위를 눌러 두 겔 저장조를 연결하는 채널 내부의 공기 방울을 밀어냅니다.펌프를 분당 5 mL 속도로 작동시킵니다. 클램프를 제거하고 겔이 유리판 사이로 천천히 흐르게 합니다. 겔이 멈출 때마다 바늘을 천천히 들어 올려, 바늘이 항상 액체 위에 있도록 유지합니다.모든 액체가 겔 장치 내부로 들어가게 합니다. 그런 다음 액체 위에 이소프로판올을 조심스럽게 덮고 장치를 증류수로 헹굽니다. 실온에서 최소 30분 동안 겔을 중합시킵니다.다음으로, 사용 직전에 PS와 TM을 첨가하여 3.2% stacking gel을 준비합니다. separating gel 위에 stacking gel을 붓고, 기포가 생기지 않도록 주의하며 유리판 사이에 comb를 삽입합니다. stacking gel이 중합되면, 시료 로딩 직전에 겔을 4 °C로 냉각합니다.콤을 젤 평면과 각도를 이루도록 천천히 당겨 제거합니다. 이렇게 하면 포켓에 공기가 빠르게 유입되어 웰의 품질이 향상됩니다. Blue Native PAGE로 투석된 세포 용해물을 분리하기 위해, 건조한 웰에 ferritin 마커 20 µL와 투석된 용해물 40 µL를 로딩합니다. 4 °C에서 빈 레인은 동일한 부피의 투석 버퍼로 채웁니다. 그 다음, 각 웰의 샘플 위에 차가운 캐소드 버퍼를 덮어줍니다.내부 챔버에는 차가운 음극 완충액을, alsa 챔버에는 차가운 양극 완충액을 채웁니다. 4 °C에서 작업하며 샘플이 분리 젤에 진입할 때까지 100 V를 가합니다. 그 다음 전압을 180 V로 높이고 염색약 전선이 젤 끝에 도달할 때까지 젤을 전기영동합니다.전개는 3~4시간 정도 소요됩니다. 2차원 SDS-PAGE를 위해, 하나의 넓은 레인이 있는 표준 10% SDS 겔을 준비하십시오. 분자량 마커용 레인 하나와 SDS 시료 버퍼와 혼합하여 95 °C에서 5분간 가열한 투석된 용해물 대조군 분주물용 레인 하나를 준비하고, 전기영동 장치에서 플레이트의 Blue Native-PAGE 겔을 꺼내 플레이트 한 쪽을 조심스럽게 들어 올리십시오.스태킹 젤(stacking gel)을 제거하고 관심 단백질이 포함된 블루 네이티브 페이지 젤(blue native page gel)의 레인을 절단하여 분리합니다. 분리한 블루 네이티브 페이지 젤 조각을 SDS 샘플 버퍼에 넣고, 셰이커 위에서 실온으로 10분 동안 배양합니다. 젤 조각을 전자레인지에 넣어 짧게 가열한 후, 다시 15분 동안 배양합니다.쉐이커 위의 SDS 샘플 버퍼 내에서 SDS 겔의 콤을 제거하고, 웰에 SDS 버퍼를 채웁니다. Blue native PAGE 겔 슬라이스를 SDS 겔의 커다란 웰에 넣습니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 겔 슬라이스가 스태킹 겔 위에 정확히 놓여야 하므로 핀셋을 사용하여 도움을 받을 수 있습니다.슬라이스 위에 SDS 샘플 버퍼를 덮은 후, 마커와 라이세이트 대조군을 로딩하십시오. 표준 프로토콜에 따라 전기영동과 단백질 전이를 수행하십시오. 결과를 해석할 때, 2차원 blue native SDS page에서 단백질의 위치가 해당 단백질이 MultiPro 복합체의 일부인지 여부에 대한 증거를 제공한다는 점을 아는 것이 중요합니다.단량체 단백질은 1차원 단계의 기울기 겔(gradient gel)로 인해 쌍곡선 대각선 방향으로 이동하며, 2차원 단계에서는 선형 겔로 이동합니다. MultiPro 복합체의 하위 단위(subunit)들은 대각선 아래에서 수직선을 형성하며 발견될 것입니다. 특정 단백질이 서로 다른 복합체의 일부인 경우, 여러 개의 스폿(spot)이 수평선상으로 검출됩니다. 요약하자면, 2차원 Blue Native PAGE 및 SDS-PAGE 접근법을 통해 MultiPro 복합체의 구성, 크기 및 상대적 함량을 결정할 수 있습니다.본 시연에서는 웨스턴 블로팅을 통해 여러 프로테아좀 또는 그 하위 단위체들을 검출하였습니다. beta two 및 CP 21 하위 단위체들은 수직으로 배열된 개별 스팟으로 검출되었으며, 이는 이들이 동일한 복합체의 일부임을 나타냅니다. PA 28은 beta two 및 CP 21과 동일한 수직선상에서 발견되었으므로, 이와 동일한 복합체의 일부인 것으로 확인되었습니다.수평선을 살펴보면, beta two와 MCP 21이 세 개의 서로 다른 복합체의 일부임을 알 수 있습니다. PA 28은 그 복합체들 중 하나에서만 발견됩니다. 따라서, 이 MultiPro 복합체들은 20s 프로테아좀으로 식별될 수 있습니다.P 28 및 20 S 프로테아좀 단독 형태와 함께, 청색 천연 젤 전기영동(blue native page)을 사용하여 세포 용해물로부터 천연 MultiPro 복합체를 분리하고 특성화하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때, 샘플을 주의 깊게 투석하는 것이 중요합니다. SDS와의 접촉을 피하고 항상 4 °C에서 작업하며, 모터 단백질 복합체의 무결성 유지와 최적의 가용화를 모두 달성하기 위해 세포 용해에 적합한 다양한 계면활성제를 비교해 보는 것을 권장합니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다. 여기서 마치겠습니다.

blue-native-polyacrylamide-gel-electrophoresis-bn-page-for-analysis

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연구

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Biology

생물학

이 기술 문서는 Invitrogen에서 상용 NuPAGE 전기 영동 미니 젤 시스템을 사용하여 표준 서양 모래 바닥 절차를 설명합니다.

웨스턴 Invitrogen NuPage Novex BIS 트리스 MiniGels를 사용하여 모래 바닥

이 비디오는 단백질에 대한 변성 폴리아크릴아미드 기반 분리 기술을 보여줍니다. 이 기술은 분자량에 따라 단백질을 예비 식별하는 데 도움이 됩니다.

단백질 분석을 위한 Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel 전기영동: 분자량에 따라 단백질을 분리하고 시각화하는 기술

이 비디오에서는 미토콘드리아 호흡 단백질 복합체를 본래 접혀 기능적으로 활성화된 상태에서 분석하기 위해 blue native PAGE라는 전기영동 기술을 시연합니다. 음이온성 Coomassie blue 염료는 단백질 복합체를 음전하로 띠게 하여 크기와 구조에 따라 분리할 수 있습니다.

파란 천연 Polyacrylamide 젤 전기 이동법: 본래 Mitochondrial 호흡 사슬 복합물의 분석을 위한 Non-denaturing 별거 기술

이 비디오는 조직 균질체에서 천연 단백질 복합체를 분리하기 위한 multimeric PAGE에 대해 설명합니다. 이 기술은 blue native-PAGE 및 SDS-PAGE 기술의 하이브리드입니다. 분리된 복합체는 세포 기능에서의 역할을 특성화하고 연구할 수 있습니다.

네이티브 단백질 복합체 분리를 위한 Multimer-PAGE: 조직 용해물에서 원형(intact) 멀티머 단백질을 분리하기 위한 블루 네이티브-PAGE와 SDS-PAGE로 구성된 하이브리드 분리 기법

이 비디오에서는 인간 비기능성 뇌하수체 선종(NFPA)의 종양 조직에서 얻은 복잡한 단백질 혼합물에서 개별 단백질을 분리하는 2차원 겔 전기영동 방법을 보여줍니다. 단백질은 1차원에서 전하를 기준으로 분리되고 2차원에서 분자량에 따라 추가로 분리됩니다.

2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 전하와 분자량에 근거를 둔 복잡한 단백질 혼합물에 있는 단백질의 분석을 위한 별거 기술

이 프로토콜은 다양한 다운스트림 단백질 분석 기술과 호환되는 이종 샘플의 비공유 생체 분자 어셈블리 및 단백질에 대한 네이티브 분리 기술인 투명 네이티브 겔 용리된 액체 분획 포착 전기영동(CN-GELFrEE)을 준비하고 수행하는 방법을 설명합니다.

CN-GELFrEE - 지우기 기본 젤 - 용출 액체 분수 내포 전기 영동

안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

여기에 우리가 큰 네이티브 단백질: 단백질 및 단백질의 단백질 구성을 분석 하는 프로토콜을 제시: oilseed 강간에서 핵 산 복합물 (B. napus) 체 관 부 exudate 블루 결합 3D polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (페이지) 방식을 사용 하 여 네이티브 대량 spectrometric 식별 뒤의 변성 페이지 두 개 (10 억).

체 관 부 수액 샘플링 브라시카 napus 단백질 및 Ribonucleoprotein 단지의 3D-페이지에서

프로토콜 식물의 해명 thylakoid 단백질 복잡 한 조직 및 구성 블루 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (BN-페이지) 및 2D SDS 페이지 설명. 애기 thaliana, 프로토콜 최적화 작은 수정으로 다른 식물 종에 대 한 사용할 수 있습니다.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

마이크로톰을 이용한 다목적 저온 분석 BN-MS 프로토콜이 고분해능 복합체 프로파일링을 위해 제시된다.

BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링

배우세요 블루 네이티브 PAGE를 이용하여 세포 용액에서 다단백질 복합체를 분석하는 방법을. 이 기술은 단백질 상호작용을 보존하며 멤브레인 수용체 구성 연구에 활용됩니다.

셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

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