반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

항원 특이적 T 세포 수용체에 대한 형질전환 마우스는 체세포 핵 전달 또는 SCNT를 사용하여 사전 정의된 T 세포 수용체 특이성을 가진 마우스 모델을 생성하는 T 세포 발달 및 기능 연구에 필수적이었습니다. 마우스가 관심 병원체에 감염되었습니다. T 세포는 마우스에서 분리된 다음 형광 활성화 세포 분류에 의해 정제됩니다.

정제된 T세포는 체세포 핵 이식에 사용됩니다. 배아가 모세포 단계에 도달한 후, 배아 줄기세포는 분리됩니다. 그런 다음 이 세포는 blast assist에 주입된 다음 가짜 임신 마우스로 전달됩니다.

그 결과 새끼는 관심 T 세포 개체군의 뚜렷한 증가를 나타내며, 이는 PAX 분석으로 검증할 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 Okta AK이고, White Institute for Biomedical Research의 후임자입니다. 오늘은 체세포 CLE 전달, 폭발 보조 주사 및 배아 전달을 수행하는 방법을 보여 드리겠습니다.

체세포 전달의 주요 장점은 내인성 유전자 자리에서 T 세포 수용체를 발현하는 마우스 모델을 생성할 수 있으므로 내인성 프로모터의 제어 하에 마우스 모델을 매우 빠르게 생성할 수 있다는 것입니다. 체세포 전송 액체 전달은 사전 정의된 T 세포 수용체 또는 B 세포 수용체 특이성을 가진 마우스 모델을 생성하는 도구로 사용할 수 있습니다. 이것은 자가면역, 전염병 및 암과 같은 분야에서 일하는 사람들에게 특별한 관심사입니다.

면역 반응이 최고조에 달했을 때 복강내 주사로 감염된 구두쇠인 톡소플라스마 간디(Toxoplasma Gandhi)와 같은 병원체에 특이적인 T 세포를 분리하기 위해 안락사된 마우스에서 비장을 분리하고 균질화된 공여자 세포를 분리하여 형광 표지된 항체와 적절한 사량체로 배양합니다. 마지막으로, 병원체 특이적 T 세포를 얻기 위해 사실 분류를 수행합니다. 난모세포 적출 시술 전날 저녁.

주사기를 사용하여 4개, 5개, 7개의 마이크로미터 피소 주사 바늘을 준비하여 수은을 역행합니다. 다음 날, 난모세포를 채취한 다음 구강 피펫을 사용하여 페트리 접시에 K-S-O-M-A-A 배지 방울로 전달하여 체세포 핵 이식 프로토콜을 시작합니다. 페트리 접시의 뚜껑에.

PVP를 약 10방울 떨어뜨려 체세포 핵 이식 또는 SCNT를 수행하기 위한 aate를 준비합니다. cyto B 1ml당 5마이크로그램을 함유하는 HCZB 약 10방울 및 cyto B 1ml당 2.5마이크로그램을 함유하는 HCCB 약 10방울을 함유하고 있으며, 이 플레이트는 S-C-N-T-A 플레이트라고 합니다. S-C-N-T-A 플레이트를 무대에 놓습니다.tage 도립 복합 현미경.

다음으로 7마이크로미터 적출 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 넣고 PVP 용액을 5-10회 폐기하여 세척합니다. 그런 다음 페트리 접시에서 10-30 중기 2 개의 정지 된 세포를 밀리리터 당 5 마이크로 그램의 HCCB 방울 중 하나로 옮깁니다. S-C-N-T-A 플레이트의 Cyto B는 배양 중 실온에서 5분 동안 배양하고 난모세포를 수평으로 정렬합니다.

5분이 지난 후. 적출 바늘을 사용하여 고정 바늘 앞에 난모세포를 놓습니다. 마이크로 인젝터를 사용하여 진공 청소기를 적용하여 난모세포를 마이크로 피펫 고정 바늘에 고정합니다.

다음으로, 적출 바늘을 사용하여 연산 플라즈마에 비해 매우 투명하게 보이는 염색체 방추체 복합체가 3시 방향 위치에 있을 때까지 난모세포를 돌리고 페달을 밟아 zno lucita를 관통하여 pizo pulse를 시작합니다. 피조 펄스(pizo pulse)는 세로로 이동하며 핵 형성 바늘의 끝을 진동시키는 기계적 펄스입니다. 팁 진동은 zop lucita를 뚫는 데 도움이 됩니다.

zona palita를 통과하면 핵 삽입 바늘의 개구부를 metaphase 2 spindle에 인접하게 놓고 진공을 적용합니다. 염색체 방추체 복합체는 천천히 바늘 속으로 이동합니다. 바늘이 제거되면 멤브레인이 스스로를 밀봉해야 합니다.

마지막으로, 구강 피펫을 사용하여 적출된 세포를 K-S-O-M-A-A 점안액으로 다시 전달합니다. 그런 다음 동일한 피펫을 사용하여 KSOM AA를 한 방울에서 한 방울로 옮겨 세척하여 마이크로 매니퓰레이터의 7 마이크로 미터 핵 제거 바늘을 4-5 마이크로 미터 핵 전달 바늘로 핵 전달 교환을 수행합니다. 이전과 같이 PVP로 바늘을 씻으십시오.

앞서 분리한 CD 8개의 양성 T 세포를 S-C-N-D-A 플레이트의 PVP 한 방울에 놓습니다. 잘 섞어 실온에서 최소 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 10-30개의 핵 세포를 밀리리터당 2.5마이크로그램의 HCZB 한 방울로 옮깁니다.

S ct의 Cyto B. 플레이트는 실온에서 5분 동안 배양합니다. 배양 중에는 핵 이식 바늘을 사용하여 주사 바늘을 사용하여 세포를 수평으로 정렬합니다.

PVP 배지에서 donor CD eight positive cell을 선택하고 외막이 파괴될 때까지 안팎으로 흡인합니다. 필요한 경우 pizo pulse를 적용하면 막과 세포질의 조각이 보여야 합니다. 핵을 바늘로 끌어 올립니다.

그런 다음 10에서 30개가 될 때까지 핵을 계속 집습니다. 다음으로, 정렬된 enucleated cyte를 포함하는 점안액으로 이동합니다. 진공 청소기를 적용하여 하나의 난모세포를 고정 바늘에 고정합니다.

그런 다음 NU 핵 전달 바늘을 zop lucita에 인접하게 하고 핵이 개구부에서 멀어지도록 놓습니다. 바늘이 zop lucita를 통과할 때까지 pizo pulse를 적용합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 밀어 하나의 핵을 바늘 끝으로 조심스럽게 이동합니다.

바늘 끝이 안쪽의 2/3가 될 때까지 바늘을 난모세포 안으로 밀어 넣습니다. 난모세포막이 바늘에 약간 들어가도록 작은 음압을 가합니다. 다음 단계는 매우 중요합니다.

난모세포가 실제로 열려 있는 유일한 시간이기 때문입니다. 단일 ZO 펄스를 적용합니다. 그런 다음 양압을 가하여 핵을 바늘 밖으로 밀어냅니다.

바늘 끝이 난모세포에서 약 1/3이 되도록 조심스럽게 뒤로 당긴 다음 음압을 가하고 바늘을 계속 뒤로 당깁니다. 난모세포를 밀봉하기 위해. 각 난모세포에 대해 이 단계를 반복합니다.

모든 난모세포가 핵을 받은 후, 이를 페트리 접시로 옮기고 최소 30분 동안 섭씨 37도에서 배양하는 KS OM AA 배지를 한 방울에서 한 방울로 옮겨 세척합니다. 배양 후, SCN T 배아를 염화스트론튬을 함유한 칼슘이 없는 활성화 배지 방울로 옮깁니다. 염화스트론튬(Strontium chloride)은 수정 중에 유사하게 발생하는 칼슘 진동을 유도하여 난모세포를 활성화합니다.

6시간 동안 배양합니다. 원하는 경우, 활성화 배지에 대한 히스톤 디아세틸 아시스의 비특이적 억제제인 ADD TSA를 활성화에 따른 효율성을 개선하기 위해 도립 현미경으로 배아를 검사하여 유사 전핵 또는 PPN 양성 SCNT 배아의 양을 측정합니다. PPN은 모양에 따라 식별할 수 있습니다.

그들은 달걀처럼 보입니다. 햇볕이 잘 드는 쪽이 씻고 문화. 배아와 K-S-O-M-A-A는 폭발 보조 단계에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 3일 반 동안 낙하합니다.

처음에는 핵형성 및 NU 핵 이식을 위해 방금 보여드린 절차를 올바르게 수행하는 데 집중해야 합니다. 이러한 기술을 마스터하면 다음 절차를 더 쉽게 관리할 수 있습니다. 사용된 배아 줄기 세포 또는 ES 세포. 다음은 표준 기술을 사용하여 파생되었습니다.

이들은 blast assisted injection을 맞은 날, cotus 후 3일 반에 준비해야 합니다. PVP와 HCZP가 함유된 방울을 도금하여 멸균 박테리아 접시의 뚜껑을 준비합니다. 그런 다음 이전과 같이 피소 펄스를 위해 15 마이크로 미터 주사 바늘을 준비합니다.

다음으로, 마이크로 매니퓰레이터에 주사 바늘을 놓고 PVP 전사로 세척합니다. 10-30 폭발은 HCZB 한 방울을 돕습니다. 그런 다음 5-50 마이크로 리터의 ESL 현탁액을 HCZB의 또 다른 방울에 놓습니다.

쉽게 집어들 수 있도록 충분한 ES 세포가 있어야 하지만 붐비지 않아야 합니다. 그런 다음 주사 바늘로 30개에서 100개의 ES 세포를 집어 올립니다. 폭발 지원으로 낙하로 이동합니다.

블라스트 어시스트를 수평으로 정렬하고 진공 청소기를 적용하여 고정 바늘로 고정합니다. 주사 바늘을 사용하여 내부 세포 덩어리가 9시 방향이 될 때까지 폭발 보조를 돌립니다. 주사 바늘을 3시 방향에 놓습니다.

바늘 끝에 ES 세포가 없는지 확인하고 주사 바늘이 zop lucita와 trifecta를 통해 blastic seal로 관통할 때까지 piso pulse를 적용합니다. 5-15개의 ES 세포를 방출하여 내부 세포 덩어리에 달라붙도록 합니다. 주입이 완료된 후 모든 폭발 보조가 주입될 때까지 계속합니다.

K-S-O-M-A-A에서 2회 세척하고 외과 배아를 진행하여 의사 임산부 부위에 의사 임산부 수혜자 마우스를 마취시켰다. 전기 면도기를 사용하여 오른쪽 하단 사분면의 머리카락을 제거합니다. 요오드 기반 용액과 70% 에탄올을 사용하여 해부 현미경으로 해당 부위를 소독합니다.

가위를 사용하여 피부를 연 다음 닫힌 가위를 피부와 복막 사이에 놓고 열어 복막을 피부에서 분리합니다. 붉은 반점으로 나타나야 하는 복막을 통해 난소를 찾습니다. 그런 다음 가위를 사용하여 해당 부위의 복막을 엽니다.

겸자를 사용하여 UCT 또는 주변 지방을 조심스럽게 잡고 구강 피펫에 연결된 모세혈관을 사용하여 자궁을 빼냅니다. 집게로 난관과 자궁을 잡고 약 10개의 폭발 보조 그룹을 선택하십시오. 바늘을 사용하여 자궁에 작은 구멍을 뚫습니다.

그런 다음 블라스트 어시스트가 있는 모세혈관을 자궁 내강에 삽입하고 방출합니다. 자궁을 복강 안으로 다시 밀어 넣는다. 복막의 가장자리를 찾아 몇 바늘 꿰매어 닫습니다.

몇 가지 스테이플로 마우스의 피부를 닫습니다. 진통제를 피하로 투여합니다. 그런 다음 마우스를 가열 램프 아래의 케이지로 다시 옮깁니다.

마우스가 깨어날 때까지 마우스의 호흡을 모니터링합니다. 적출 및 체세포 핵 이식 후. 배아의 약 70%가 가성 전핵(pseudo pronuclei)에 양성이었습니다.

이 그림과 같습니다. TSA로 6시간 또는 10시간 동안 치료해도 효과가 없었다. 배양에서 3일 반이 지난 후, 배아의 5-10%가 폭발 보조로 발달했습니다.

다시 말하지만, TSA의 추가는 폭발 보조 개발 속도에 영향을 미치지 않았습니다. 그런 다음 SCNT blast assist를 사용하여 배아 줄기 세포를 추출했습니다. TSA는 폭발 지원에서 ESL이 파생되는 비율을 크게 개선했습니다.

S-C-N-T-E-S 세포는 키메라 마우스를 생성하는 데 사용됩니다. 이 마우스에서 혈액을 채취하고 여기에 표시된 것처럼 사실 분석을 사용하여 특정 T 세포의 존재 여부를 분석합니다. 혈액이 항 CDA 항체와 특이 사분체로 염색되면 이중 양성 집단을 식별할 수 있습니다.

SCNT에 사용된 공여자 세포가 올바른 특이성을 가졌음을 나타냅니다. 방금 체세포 LU 이식, 폭발 보조 주사 및 배아 이식을 수행하는 방법을 보여드렸습니다. 고려해야 할 가장 중요한 점은 T 세포 또는 B 세포의 순도입니다.

체세포 이식을 수행하는 방법을 배우고 배아가 폭발 단계에 이르면 의사 임신한 여성에게 직접 이식하거나 배아 줄기 세포를 추출하고 키메라 마우스를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.