Name: 의 입식 이미징 Drosophila 태아 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 배우세요 Drosophila 태아의 입식 이미징 방법으로, 글리세린 젤리를 이용해 태아를 세워 고정하고 공초점 현미경으로 단면을 촬영합니다. 이 기술은 발생생물학 연구에서 유전자 발현과 단백질 수준을 정량 분석하는 데 활용됩니다.

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저자 데보라 해리스와 다니엘 맥케이 특히 빚을 수 있습니다. 이 작품에 대한 지원이 생물학과 CWRU의 예술과 과학의 대학의학과에서 제공하고, 생물 학적 과학의 학부 교육에 대한 지원 HHMI 부여 번호 52005866로.했습니다

1. 이미징 방법론 <ol><li> 그것은 동질적인 액체 될 때까지 20~30분을위한 55 ° C 학위 물 목욕에 젤리 글리세린을 용융. 소용돌이하지만, 거품의 형성을 피하기 위해 병을 흔들지 마세요. </li><li> 젤리가 녹으 동안 깨끗한 유리 슬라이드 (옵션)에 Kimwipe를 사용하여 글리세롤의 얇은 레이어를 적용합니다. </li><li> 녹은 글리세린의 피펫 1-1.5 ML 젤리 얇은 첫번째 레이어를 만들려면 슬라이드의 표면에 상처의 P1000의 피펫 팁을 사용합니다. 거품을 피하기 위해 조심스럽게 피펫. </li><li> 젤리가 수평 표면에 5 분 후, 5 분 -20 ° C에서 슬라이드를 장소와 배아 정렬로 이동합니다 고체화하자. 또는 사란 랩과 슬라이드를 커버하고 최대 5 일 4 ° C에서 그것을 놓으십시오. </li><li> 젤리 침구의 측면에 70 % 글리세롤 / PBS 또는 기타 antifade 글리세롤 기반 설치 미디어 (예 : Slowfade 또는 Vectashield)의 스테인드 배아의 작은 방울 피펫. </li><li> 개별적으로 젤리 표면에있는 드롭에서 그들을 전송하여 배아를 미리 정렬 시작합니다. 숟가락으로 한쪽으로 치우 쳤던 측면을 사용하여 한쪽으로 치우 쳤던 피하 바늘을 사용하여 전송합니다. </li><li> 대략 2-3 열 함께 배아를 놓습니다. 태아가 바늘에 걸리면, 다른 배아 그것을 릴리스가 포함된 드롭에 저어. 신중하게이 시점에서 그들을 정렬 시간을 낭비하지 마십시오. 열 사이에 공간을 둡니다. </li><li> 피하 바늘의 도움으로 젤리 매체에 수평을 슬라이딩하여 배아를 맞춥니다. 동안 슬라이딩, 방향 같은 방향으로 머리와 꼬리. 열에 따라 서로 그들이 평행합니다. 뒤틀린 Kimiwipe의 조각 흔적으로 남아 PBS의 글리세롤의 초과를 제거합니다. 참고 : 초과의 글리세롤이 어려운 잘라 탑재하고, 두 젤리 레이어의 분리의 결과로, 배아는 젤 이내 느슨하게 쌌다도록합니다. 반대로, 너무 글리세롤을 제거하는 건조하고 배아를 평평하게합니다. </li><li> 배아 (50-150 μL, 정렬 얼마나 많은에 따라 다름)를 통해 젤리의 얇은 레이어를 확산하기 위해 상처 노란색 팁을 사용하십시오. </li><li> 플레이스 10-20 분 -20 ° C의 냉동고에 슬라이드 또는 4 ° C 야간에 그것을 저장합니다. 젤리가 절단하기 전에 완전히 딱딱한 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면, 배아의 블록 소비세 매우 어려운 것입니다. 절단에 대한 최상의 결과는 그 다음날에 얻을 수 있습니다. </li><li> 해부 현미경, 정렬 태아의 양쪽에있는 젤리를 통해 완전히 잘라 면도날을 사용합니다. 바로 상처를 만들기 위해 90 ° 각도로 면도날을 잡아. 상처는 이미지를 막지 수 있습니다 여분의 젤리를 피하기 위해 태아의 앞쪽에 및 사후 기둥 매우 가까이하여야한다. </li><li> 추운 PBT (4 ° C, PBS 0.1 % 트윈 20) 상처 조심스럽게 주걱을 사용하여 태아 사이의 젤리를 긁어 옆에.의 100-200 μL 추가 참고 : PBT의 세제는 배아를 손상하지 않고 슬라이드에서 젤리의 제거를 도와줍니다. </li><li> 바늘을 사용하여 더욱 절단을위한 깨끗한 슬라이드에 포함된 배아와 젤리의 블록을 전송합니다. 5-7 배아와 작은 블록을 잘라. 쉽게 젤리 블록 이동에 PBT를 사용합니다. 또는, 그것이 필요한 경우 정확하게, 젤리를 트리밍에 대한 더 안정성을 만드는 유리에 부착하도록 건조 유리 표면에 블록을 놓으십시오. </li><li> 면도날과 바늘의 도움으로 젤리에 포함된 똑바로 배아를 플립. 현미경 시각화 들어, 사용중인 스탠드 현미경의 종류에 따라 아래의 두 단계 중 하나를 진행합니다. </li><li> 거꾸로 현미경 : 장소가 직립 위치에 태아와, 긴 coverslip에 배아 블록을 완료했다. 젤리의 최소 금액과 함께 배아의 측면이 목적으로 가까이 접촉하는 것임을 확인합니다. </li><li> 입식 현미경 : "지원"으로 사용하고있는 "지원"사이에 글리세롤의 배아 블록을 배치하는 superglue와 붙어 네 # 1 coverslips 두 개의 스택을합니다. 긴 coverslip을 사용하여 스택을 다리. </li><li> 공촛점 분석을 위해, 확인하는 데 사용할 목적의 작업 거리를 확인해 이미지 배아를 통해 모든 방법을하거나 일부만 여부. 예를 들어, D. melanogaster의 배아는 길이 ~ 0.55 mm을 가지고 전적으로 자이스 혈구 20x 계획 - APO 또는 40x LD 네오 플루어 목표를 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 다음 웹 사이트를 사용할 수 자이스 혈구의 목표에 대한 정보를 가지고 여러분에게 작업 거리에 따라 목표를 검색할 수있는 옵션을 제공합니다 : https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php을 </li></ol> 2. 대표 결과 배아가 그대로 유지되기 때문에이 방법은 태아의 크기와 유전자 발현 패턴 사이의 거리의 정확한 측정을하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1에서, 우리는 핵 얼룩 DAPI (파란색), 안티 도설 단백질 (적색), SOG의 mRNA (노란색)와 SNA의 mRNA (녹색)와 스테인드 배반엽 스테이지 배아를 보여줍니다. 형태학의 procesSES, mesoderm의 invagination (그림 2A, B)와 mesodermal 세포 (그림 3 및 4)의 마이 그 레이션 등도이 방법을 사용하여 시각하실 수 있습니다. DV의 축을 따라 다른 Z - 위치가 같은 그림 2-4과 같이 초점 비행기를 변경하여 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 배반엽 단계에 손상 배아의 직립 광학 조각. mRNA와 단백질에 대한 이중 염색법. 현장 프로브의 (SOG 및 SNA)과 기본 항체 (안티 도설)의 스테인드 단백질에 대한 대상 mRNAs는 그림 표시됩니다. DAPI는 핵 레이블에 사용되었습니다. 도설의 표현이 핵 동안 SOG와 SNA의 표현이, 세포질에 apically 위치됩니다. 핵에 위치하고 있습니다 SOG 초기 성적에서 강한 신호도이 확대에서 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 손상 gastrulating 배아의 직립 영상. mRNA 프로브는 사용하고 각각의 색상은 그림 표시됩니다. A)이 단계에서, 세 유전자 같은 플루어 (녹색 SNA, SOG 및 dpp)와 스테인드합니다이 공간 분리 도메인에서 표현됩니다. invaginating mesoderm은 SNA를 표현, neuroblast 계층이 산업을 표현하고 SOG의 표현은 여전히 신경 시스템의 복부 지역에있는 동안 ectoderm은 dpp를 표현합니다. B) 같은 배아의 깊이 공촛점 비행기, 우리는 강하게 SNA을 표현 invaginating mesoderm의 기반을 참고하지만, 그 꼭대기의 지역은 낮은 수준을 표현하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. . 달팽이, 산업 및 dpp의 mRNAs (녹색), 도설 단백질 (빨간색), 세균 밴드와 손상 배아의 입식 영상은 SOG RNA (노란색)을 확장. 핵은 DAPI (파란색)와 스테인드되었습니다. 배아의 머리 근처) 초점 비행기. 같은 배아의 트렁크 지역에서 B) 또 다른 초점 비행기. 세균 밴드 확장 배아의 양쪽에 가까운 복부 정중선 거짓말하는 측면 마이 그 레이션하기 전에 mesodermal 세포 (4 그림과 비교할 때)의 참고 질량. Delaminating neuroblasts는 녹색 (산업 및 SNA)에 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 세균 대역 확장하는 동안 손상 배아의 입식 이미징 SOG RNA (노란색). 달팽이, 산업 및 dpp의 mRNAs (녹색), 도설 단백질 (빨간색). A), 상피 (화살표)에서 delaminating neuroblasts 참고이 단계 (녹색)에서 산업 및 SNA에 대해 모두 스테인드. SOG의 제한된 표현은 배면의 정중선 (노란색) 또한 있습니다. 이 단계에서 dpp 표현은 배아 (별표)의 측면 양쪽에서 볼 수 있습니다. B) 같은 배아의 광학 섹션 중순 후부 지역에 해당하는 배아 길이의 끝 부분에 표시됩니다. 복부 정중선 세포가 SOG를 위해 얼룩이 있습니다.

<ol><li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li>
<li>Grβhans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li>
<li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22The+Bryologist%22%5BJournal%5D)">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li>
<li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

그것이 조각 2 보통 형광 stainings에 대한 해로운 것입니다 마이크로톰 처리, 임베디드 미디어의 사용 중주의 손 절개를 필요로하기 때문에 Drosophila의 배아의 단면 이미지를 촬영하는 것은 도전하실 수 있습니다. 또는 공촛점 현미경에서 만든 Z - 스택은 단면 이미지의 3D 재건을하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 정확한 3D 재건과 photobleaching problematical되어 여러 얇게 공촛점 조각 만들기 위해 소모 시점입니다. 길이 방향 탑재되어 영상 태아도 단백질 또는 mRNA 표현 수준 1 부량의 목적을 위해 형광 신호의 정확한 측정을 복용 복잡 배아의 깊은 부분에 도달하면 발생하는 광 산란 또 다른 관심사. 심지어 두 광자 공촛점 현미경으로 빛이 산란은 여전히​​ 제한 샘플 최적의 투명성에 대한 설치 매체의 선택을 만드는 배아의 중간에 노른자 소재의 불투명도에 의한 관심사입니다. 이러한 문제를 회피하려면, 위치 배아의 &quot;최종의&quot;이미지라는 새로운 기술은 수직으로 최근 4 살 및 고정 샘플 모두 이미지로 개발되었습니다. 본 논문에서는, 우리는 현장 프로브 3 여러 물들일되는 크기와 모양의 고정 배아 또는 조직의 간단한 준비 및 시각화를 허용 수직으로 장착 태아를위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 우리의 방법은 그 안에서 정렬 배아를 싸는 데 사용되는 젤라틴 일관성있는 장착 미디어를 사용하여 구성됩니다. 임베디드 배아를 포함하는이 장착 미디어 컷 블록은 공촛점 현미경의 어떤 유형의 이미징 전에 직립 위치 수 있습니다. 젤리에 배아를 포함하고 수직으로 그들을 위치함으로써, 우리는 배아의 지느러미 - 복부 축을 따라 세포가 동시에 제공되는 공촛점 현미경을 사용하여 수평 교차 섹션을 수 있습니다. 이것은 빛을 산란과 길이 방향 탑재 배아들 중 기존의 Z - 스택 재건에서 발생하는 형광 염료의 photobleaching 지금 제거 아르의 문제 때문에 부량을 위해 상당한 개선이다. 반대 지느러미 - 복부 위치에있는 세포가 동시에 같은 공촛점 Z - 위치에서 몇 군데 있기 때문에 따라서, 지느러미 - 복부 축을 따라 유전자 발현 또는 단백질 수준의 부량은 정확합니다. 또한, 설명 방법은 우리가 DV 축 6 따라 다른 위치에 세포를 시각화하기 위해 복잡한 계산 unrolling 방법을 사용하지 않고 3 - D 배아에서 지느러미 - 복부 축에 걸쳐 완벽한 2 - D 이미지를 얻을 수 있습니다. 중요한 단계 중 일부는 젤리의 두 레이어 사이의 분할 피하기 위해, 배아를 정렬 후 여분의 글리세롤을 제거 있습니다. 그러나, 샘플도 탈수있다면, 그 결과 이​​미지가 결함이하고 잘못된 형태가됩​​니다. 배아 주변 젤리 매체가 아니라 바로 이상의 각도로자를 경우뿐만 아니라, 결과 이​​미지는 90도 이외의 각도로 배아의 잘못된 위치로 인해, 모양의 적은 둥근 더 ovular 나타날 수 있습니다. 젤리가 앞쪽에 / 사후 끝에 배아와 밀접하게 충분한 절단되지 않는 경우 마지막으로, 그것은 목표의 작동 거리가 주로 젤리 아니라 배아에 초점을 사용하는 것입니다 때문에 적절한 이미지를 얻을 수 없습니다. 영상 후반 gastrulating 배아는 신중하게 정렬하기 전에 범위에 따라 관심의 단계를 정렬할 때 필요할 수 있습니다 또 다른 중요한 단계. 보통 태아는 세로 위치에서 가장 쉽게 인식된다 형태학의 특성에 따라 개최됩니다. 이 방법으로 만들 수 대체 수정 중에서 형광 염료의 photobleaching으로부터 보호하기 위해 젤리의 두 번째 계층에 방지 퇴색 시약 (예 : P - Phenylenediamine 또는 PPD) 포함하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>글리세린 젤리 봉입제 (Glycerin Jelly mounting media)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17998-10</td><td>보존제로 저농도의 페놀이 포함되어 있으므로 흄 후드 또는 환기가 잘 되는 곳에서 사용해야 합니다. 자체 봉입제 제조법은 Zander, 1997에 기술되어 있습니다.</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 700 공초점 현미경 (Zeiss LSM 700 Confocal)</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>다음의 대물렌즈가 사용되었습니다: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td></tr><tr><td>0.1% Tween 20 포함 인산염 완충 식염수 (PBT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72204-02</td><td>크기 1 &amp;#189; (본 연구에 사용된 대물렌즈 전용).</td></tr><tr><td>유리 커버슬립 (지지대 제작용)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>순간접착제로 접착한 4개의 커버슬립을 사용하십시오.</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td></td><td></td><td>강철 배면 단면 산업용 날</td></tr><tr><td>스패출러</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>피하 주사 바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482610</td><td>26 Gauge</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Labnet International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

의 입식 이미징 drosophila 태아

Upright Imaging of Drosophila Embryos

몇 가지 잘 알려진 morphogenetic의 그라디언트 및 세포 움직임의 지느러미 / 복부 축을 따라 발생<em&gt; Drosophila</em&gt; 배아. 그러나, 이러한 프로세스를 보려면하는 데 사용되는 현재의 기술은 다소 제한됩니다. 다음 프로토콜은 고정 및 라벨 장착을위한 새로운 기술을 설명합니다<em&gt; Drosophila</em&gt; 공촛점 이미지와 코로나 볼 배아. 이 방법은 글리세린 젤리 장착 미디어의 두 레이어 사이의 배아를 포함 구성되어 및 이미징 젤리 스트립은 직립 위치. 배아를 sandwiching위한 첫 번째 단계는 슬라이드에 글리세린 젤리의 얇은 이불을하는 것입니다. 다음 배아는 신중하게이 표면에 정렬과 젤리의 두 번째 계층 덮여있다. 두 번째 레이어가 확정되면 젤리의 스트립은 절단 및 이미징을위한 직립 뒤집혀 있습니다. 대안은 사용할 수 현미경 스탠드의 종류에 따라 배아를 시각화에 대해 설명되어 있습니다. 지느러미 - 복부 축을 따라 모든 세포가 하나의 공촛점 Z - 비행기 내에 몇 군데 있기 때문에, 우리의 방법은 길이 방향 탑재 배아의 3D reconstructions 일반적인 분산을 photobleaching 또는 조명없이 정확한 측정과 형광 신호의 비교를하실 수 있습니다.

여기 스테인드에 대한 마운트 프로토콜을 제시<em&gt; Drosophila</em&gt; 공촛점 현미경을 사용하여 크로스 - 섹션의 영상을 허용 직립 위치에 배아.

의 입식 이미징 Drosophila 태아

초파리 배아의 배측/복측 축을 따라 여러 잘 알려진 형태발생 기울기(morphogenetic gradients)와 세포 이동이 일어납니다. 하지만 현재의 ...

다음 실험의 전반적인 목표는 공초점 현미경을 사용하여 온전한 oph 배아의 관상면 관찰 이미지를 얻는 것이며, 이를 통해 배아의 크기를 정밀하게 측정하고 단백질 및 RNA 발현 수준을 정량화할 수 있습니다. 이는 젤라틴 형태의 고정 매질을 사용하여 배아를 감싸고 수직으로 위치시킴으로써 달성됩니다. 첫 번째 단계로,배아를 얇은 글리세린 젤리 층 위에 정렬한 다음, 이 배지를 두 번째 층으로 덮어줍니다. 다음으로, 배아가 포함된 마운팅 배지를 블록 형태로 자르며, 이를 수직으로 뒤집어 고정할 수 있습니다. 이미징을 위해 배치된 배아로부터 공초점 현미경을 통해 시각화된 단면 이미지를 얻을 수 있습니다.안녕하세요, 제 이름은 Milu입니다. 저는 케이스 웨스턴 리저브 대학교 생물학과 Meso Lab의 대학원생입니다. 오늘은 공초점 현미경을 사용하여 PHI 배아를 가로 방향으로 이미징하기 위한 마운팅 프로토콜을 시연하겠습니다.우리는 Case의 발생생물학 강의실에서 Dr.와 협력하여 이 방법을 개발했습니다. Mindin 연구소에서 개발한 Endon 이미징 기술과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 크기와 모양에 관계없이 고정된 배아나 조직을 간단하게 준비하고 시각화할 수 있다는 점입니다. 우리는 처음 이 방법의 아이디어를 얻었을 때, 수작업으로 절단하기 매우 어려운 다른 gesso 종의 매우 작은 배아 횡단면을 시각화해야 했습니다. 이 방법은 배측-복측 축(dorsal ventral axis)을 따라 유전자 발현과 단백질 수준을 정밀하게 정량화함으로써 발생생물학 분야의 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다.일반적으로 배아는 세로 방향으로 고정합니다. 횡단면의 Zack 재구성 영상을 얻는 것이 가능하긴 하지만, 형광 눈의 광퇴색이나 빛 산란 문제가 자주 발생하며 시간이 매우 많이 소요됩니다. 본 기술은 배아의 횡단면 영상을 단일 공초점 포인트에서 시각화하므로 이러한 문제들을 최소화합니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 배아의 끝부분 근처에서 글리세린 졸리 블록(glycerin jolly blocks)을 절단할 때 어려움을 겪을 수 있습니다. 이 과정은 세심한 조작이 필요하므로 시각적인 시연이 매우 중요합니다. 오늘은 저희 학생인 Catherine Chen과 catty가 drosophila 배아를 직립 이미징(upright imaging)용으로 준비하는 과정을 시연하겠습니다.먼저 글리세린 젤리를 55 °C 항온 수조에서 20~30분 동안 균질한 액체 소용돌이가 될 때까지 녹입니다. 이때 기포 형성을 방지하기 위해 병을 흔들지 마십시오. 끝을 자른 P 1000 피펫 팁을 사용하여 녹은 글리세린 젤리 1 mL를 슬라이드 위에 조심스럽게 분주합니다.기포 없이 얇고 균일한 첫 번째 층을 만들기 위해, 젤리를 수평면 위에서 5분 동안 굳힙니다. 그 다음 슬라이드를 -20°C 냉동고에 5분 동안 둡니다. 또는 슬라이드를 플라스틱 랩으로 덮어 4°C에서 최대 5일 동안 보관할 수도 있습니다.첫 번째 젤리 층이 응고되면, 슬라이드를 현미경으로 옮겨 배아 정렬을 진행합니다. 염색된 배아 소량과 70% PBS 글리세롤을 첫 번째 젤리 층의 측면에 피펫으로 분주합니다. 현미경 하에서 배아를 슬라이드당 3~4개 열로 나란히 정렬합니다.피펫 팁이나 주사침의 경사진 측면을 스푼처럼 사용하여 배아를 떠냅니다. 주사침을 이용해 배아를 젤리 배지 위에서 수평으로 밀어 모든 배아의 머리가 같은 방향을 향하도록 조심스럽게 정렬합니다.정렬된 배아의 최종 구성은 DNA 주입 시 설명한 것과 유사합니다. 꼬아 놓은 킴와이프(Kim wipe) 조각을 사용하여 배아에서 과잉의 PBS 글리세롤을 제거하십시오. 배아의 수에 따라 50에서 300 µL의 녹인 글리세린 젤리를 배아 위에 조심스럽게 피펫팅하여 두 번째 젤리 층을 만듭니다.마지막으로, 슬라이드를 -20 °C에서 5~10분 동안 냉각하거나 4 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 해부 현미경 하에서 이미징을 위해 슬라이드에서 글리세롤에 고정된 배아를 제거하려면, 정렬된 배아의 앞쪽과 뒤쪽 측면에 가깝게 젤리를 면도날로 절개하십시오. 이때 면도날을 90도 각도로 유지하십시오.직선으로 절단하려면 절단 부위 옆에 차가운 PBT 100~200 µL를 추가하십시오. 배아 주변의 젤리를 조심스럽게 긁어내십시오. 스패튤라를 사용할 때 PBT는 배아 덩어리가 잘 떨어지도록 돕습니다.추가 절단을 위해 블록을 건조한 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 먼저 내부에 5~7개의 배아가 포함되도록 작은 블록으로 절단합니다. 그 다음, 이미징을 방해할 수 있는 과도한 글리세린 젤리를 다듬어 제거합니다.마지막으로, 면도날과 바늘을 사용하여 매립된 배아를 똑바로 세운 위치로 뒤집습니다. 도립 공초점 현미경을 사용하여 초파리 배아를 시각화하려면, 배아가 포함된 젤리 블록을 커버슬립 위에 올립니다. 이때 젤리의 양이 가장 적은 배아 부위가 대물렌즈에 더 가깝게 접촉되도록 하십시오.정립 현미경을 사용하여 이미징하는 경우, 수프라 글루(supra glue)로 네 개의 적층 구조를 만드십시오. 첫째, 지지대로 사용할 커버 슬립을 준비하고 그 사이에 글리세롤에 담긴 배아 블록을 배치합니다. 공초점 분석을 위해 더 긴 커버 슬립을 사용하여 적층 구조들을 연결하십시오.시료를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 사용할 대물렌즈의 작동 거리를 확인하여 배아 전체를 이미징할 수 있는지 또는 일부만 가능한지 판단하고, 여기에서 보여주는 것과 같이 이미징을 시작하기 위해 컴퓨터에서 공초점 설정을 구성합니다. 프로토콜이 정확하게 수행되었다면, 배아가 온전하게 유지되었으므로 형태학적 구조가 보존된 배아의 횡단면 이미지를 관찰할 수 있습니다.이 방법은 배아의 크기와 배측-복측 축(dorsal ventral axis)에 따른 유전자 발현 수준을 정밀하게 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 숙련되면 이 기술은 30분에서 45분 내에 완료할 수 있습니다. 배아 위에 두 번째 글리세린 젤 층을 붓기 전에 과잉 글리세롤을 제거하는 것이 중요합니다.그렇지 않으면 두 층이 분리되어 절단 단계가 더 어려워질 수 있습니다. 또한, 사용 중인 대물렌즈의 작동 거리를 확인하여 배아 전체를 촬영할 수 있는지 또는 일부만 가능한지 확인해야 하는데, 이는 작동 거리가 촬영 가능 범위에 제한을 주기 때문입니다. 대물렌즈 쪽으로 향하게 될 배아 측면의 젤리를 밀착하여 절단하십시오.그렇지 않으면 배아가 아닌 젤리만 촬영하게 될 것입니다. 이 영상을 통해 Joseph 배아의 단면 영상을 촬영하는 방법에 대해 충분히 이해하셨기를 바랍니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Mesoscopic 형광 tomography는 조직 sectioning 형광 현미경의 침투 제한없는 운영하고 있습니다. 이 기술은 다중 투영 조명 및 광자 수송 설명을 기반으로합니다. 우리의 morphogenesis의 인 - 생체내 전체 - 몸 3D 시각화 GFP - 표현에 날개 imaginal 디스크를...

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Drosophila Pupal의 복부 Immunohistochemistry

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

이 프로토콜은 살아있는 초파리 번데기 눈 신경 상피를 이미징하는 효율적인 방법을 제시합니다. 이 방법은 조직의 움직임과 불균일한 토폴로지를 보상하고, 여러 GFP 태그가 지정된 접합 단백질을 사용하여 세포 경계의 시각화를 향상시키며, 쉽게 조립할 수 있는 이미징 장비를 사용합니다.

의 라이브 영상 초파리 번데기 눈

이 프로토콜에 설명된 직립 이미징 방법을 사용하면 발달 중인 Drosophila melanogaster 난자의 극을 자세히 시각화할 수 있습니다.  이 최종 보기는 여포 상피에서 여러 세포 유형의 배열과 형태에 대한 새로운 관점을 제공합니다.

의 수직 이미지<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 챔버

우리는 쥐 배아의 3차원(3D) 이미지를 획득하기 위해 고해상도 에피스코픽 현미경을 사용하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 개선된 프로토콜은 변형된 조직 준비 방법을 사용하여 형광 염료의 침투를 향상시켜 소형 및 대형 표본 모두에 대한 형태 분석을 가능하게 합니다.

3 차원 영상의 신속한 획득 고해상도 Episcopic 현미경을 사용하여

이 프로토콜은 장기적인 ex vivo 배양과 Drosophila imaginal disc의 라이브 영상에 대한 상세한 방법을 설명합니다. 눈 디스크의 10 시간의 라이브 영상에서 광 수용체의 분화 및 구강 내 회전을 보여줍니다. 이 프로토콜은 간단하며 값 비싼 설정이 필요하지 않습니다.

장기의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 아이 디스크

마이크로컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 개발 단계에서 온전한 드로소필라 멜라노가스터를 시각화할 수 있는 프로토콜이 제시된다.

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

이 프로토콜들은 대조군과 돌연변이 초파리 배아 상피에서 주름 격격 접합부의 조직 및 폐쇄 기능을 어떻게 특성화할 수 있는지 개괄합니다.

초파리 배아 상피에서 코어 주름 부분 격지 접합 단백질을 규명하기 위한 면역염색 및 염료 침투 실험

배우세요 Drosophila 태아의 입식 이미징 방법으로, 글리세린 젤리를 이용해 태아를 세워 고정하고 공초점 현미경으로 단면을 촬영합니다. 이 기술은 발생생물학 연구에서 유전자 발현과 단백질 수준을 정량 분석하는 데 활용됩니다.

의 입식 이미징 Drosophila 태아

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