Name: 이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: 학습하세요 GRK 이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 방법을 포유 동물 세포에서 수행하는 전체 세포 패치 클램프 기법을 통해. 이 프로토콜은 신경과학 및 질병 연구에 필수적인 전기생리학적 기술을 제공합니다.

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알코올 남용에있는 국립 연구소에서 PA에 미리 박사 NIH NRSA 교제 (F31AA017042), 우리의 작품은 신경 과학 (PAS), 약물 남용에있는 국립 연구소 (PAS R01 DA019022)에 대한 맥나이트 엔다우먼트 기금의 재정 지원으로 가능하게되었다 그리고 알콜 중독. GIRK2 - L257W 돌연변이 박사 Prafulla Aryal에 의해 제공되었다. 형광 현미경과 후원은 친절 Leica 악기에 의해 제공됩니다.

1. 사이트 돌연변이 유발을 감독 우리는 GIRK2에 대한 포유 동물 표현 플라스미드 pcDNA3.1 인코딩에게 cDNA를 사용하여 제조 업체의 지시에 따라, Stratagene (애질런트 테크놀) Quikchange XL II 사이트 - 감독 돌연변이 유발 키트를 사용하여 점 돌연변를 소개합니다. Primers 순서 쉽게보실 수 온라인 프라이머 디자인 프로그램을 사용하여 생성할 수 있습니다 : <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> 참고 : 우리는 프로토콜에 설명된 BD 14 ML 튜브 대신에 표준 Eppendorf 1.5 ML 튜브를 사용합니다. 하지만, XL10 - 골드 ultracompetent E.의 사용 β - 메르 캅 토 에탄올과 pretreated 대장균, 30 열 충격 시간 및 NZY + (또는 NZYM +) 미디어 성공적인 돌연변이 유발을 위해 중요하다. 가능하면, 새로운 제한 사이트를 만들고 추가 자동 변이를 엔지니어링하는 것은 아래의 돌연변이 식민지를 심사 편리하실 수 있습니다. 2. Miniprep, DNA 시퀀싱 및 Maxiprep 2.1 Qiagen miniprep 및 시퀀싱. 개인 세균성 식민지가 들어서 암피실린 (AMP)와 LB의 수프에서 재배하고 있습니다. 우리는 cDNA를 정화에 대한 제조 업체의 지침을 따릅니다. 제한 사이트가 위의 1 단계에서 통합하는 경우에는 간단한 제한 소화는, 돌연변이의 성공적인 도입 확인할 수 있습니다. 자동 DNA 시퀀싱이 꺼져 사이트 완료 및 cDNA의 변이의 존재를 확인하기 위해 필수적이다뿐만 아니라, 원치 않는 돌연변이가 있는지 여부를 평가합니다. 이 단계는 매우 중요합니다. 우리는 순서 앞으로 T7 프로 모터 및 BGH 시퀀싱 primers 리버스를 사용하여 전체 GIRK 코딩 순서를 그 pcDNA3.1 플라스미드의 측면 여러 복제 사이트. 참고 : 조심스럽게 시퀀싱 데이터의 충분한 품질을 보장​​하기 위해 시퀀싱 electropherogram를 검사하는 것이 중요합니다. 고품질 electropherogram는 작은 잡음과 날카로운 아닌 중복 봉우리가 있습니다. 2.2 Qiagen maxiprep. 우리는 제조 업체의 지침을 따릅니다. 참고 :이 단계는 우리가 효율적인 transfection을 위해 중요하다 발견 cDNA의 순도를 개선하기위한 실험에 포함되어 있습니다. 3. HEK293T 셀의 문화와 Transfection 이러한 모든 방법은 무균 조직 문화 후드에서 수행되어야합니다. 3.1 세포 배양 HEK293T 세포들은 (37 ° C. 5 % CO 2 humidified 인큐베이터) 문화에 쉽게되기 때문에 사용이 편리합니다 빠른 복제 시간, 높은 transfection 효율을 가지고 있으며 전체 세포 패치 - 클램프 전기 생리학 의무가 있습니다. HEK293T 전지는 플라스미드 pcDNA3.1의 episomal 복제를 보장 SV40 큰 T 항원을 표현. HEK293T 세포는 L - 글루타민과 함께 보충 낮은 포도당 DMEM 미디어와 10 % 태아 소 혈청 (FBS)의 양식입니다. passaging 세포, 세포가 / FBS를 포함하는 새로운 미디어를 추가하여 효소 활동을 중지 후, 조직 접시에서 분리 때까지 기다려, 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 합류 (90-95%) HEK293T 세포에 0.25 %를 추가합니다. 플레이트 ~ 1 X 10 5 셀 / 물론 함께 잘 당 항생제없는 문화 미디어 1 ML과 12 잘 세포 배양 접시에. (1 X 10 5 세포 10 ML 미디어 resuspended 합류 T25 플라스크에서 얻은 세포 현탁액의 ~ 350 μL입니다.) 3.2 Transfection 8-24 시간 후, HEK 세포가 플라스틱을 준수하고 transfection 준비합니다. cDNA 0.2 μg 채널, Invitrogen Lipofectamine 2000을 사용하는 cDNA 0.4 μg의 M2R 수용체 cDNA와 0.04 μg의 YFP와 Transfect 세포. 참고 :이 성공적으로 (녹색 세포가 가능성이 GIRK 채널과 M2 수용체 모두를 포함) transfected있는 세포를 확인하기 위해 cDNA YFP의 소량을 사용합니다. 사용하는 cDNA의 농도는 각 클론에 따라 조정해야합니다. transfected 세포의 형광 시각화 3.3. 장소는 12 - 잘 바뀌 형광 현미경의 무대에 접시와 YFP 표현 세포를 검사합니다. DIC 이미지를 비교하고 녹색 세포의 대략적인 개수를 적어 둡니다. 이것은 transfection 효율을 예측할 수 있습니다. 24 잘 요리와 폴리 - D - 라이신 코팅 커버 풀렸는데 3.4 준비 탈이온수로 세탁과 야간 95 % 에탄올에 흔들어 다음, Radiacwash과 함께 하루를 흔들어하여 12mm 유리 커버 풀렸는데 (워너, CS - 12R)를 청소합니다. 사용까지 70 % 에탄올에 깨끗한 커버 전표를 저장합니다. 에탄올과 페트리 접시, 포셉 및 버너를 사용하여 에탄올에서 불꽃,에 넣어 커버 풀렸는데멸균 24 잘 판 잘 하나에서 D 플레이스. 폴리 - D - 라이신 250 μL (PDL) 솔루션 각각 잘 커버 [0.2 MG / ML]와 커버 전표가 하룻밤 사이에 불임 후드 아래에 PDL 솔루션에 열중 앉아 보자. 증발을 피하기 위해 Parafilm에 24 접시를 잘 싸서. 다음 날 아침, PDL을 기음과 멸균 물로 2 배 씻는다. 플레이트 커버 후, 후드 아래에 건조 열어두고. 코팅 커버 전표로 24 잘 요리는 무균 알루미늄 호일로 싸서 주 동안 실온에서 저장할 수 있습니다. 커버에 3.5 도금 transfected HEK293T 전지는 풀렸는데 24 유리 커버를 포함 24 자 요리 (~ 4 X 10 3 셀 / 음)에 transfection, 세포 분할 후 폴리 - D - 라이신과 코팅 전표. 참고 : transfected 세포는 24-72 시간 게시물 transfection까지 사용할 수 있습니다. 세포 패치 클램프 전기 생리학 실험 개별 표지 전표를 제공하기 위해 분할됩니다. 4. 전기 생리학 4.1 준비 솔루션 세포외 (목욕) 솔루션 : 20 MM KCl, 140 MM NaCl, 0.5 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 10 MM HEPES (NaOH로 pH를 7.4로 설정). 나누어지는 20K 목욕 솔루션과 적절한 모듈 레이터를 추가 <ul><li> 20K + 바 2 + : 1 MM BaCl 2가 포함된 솔루션 : 내향 정류 전류 특정 억제제 </li><li> 20K + Carbachol : 5 μm의 Carbachol와 솔루션 : 특정 M2R의 작용제, G - 단백질 M2R 커플 오픈 GIRK 채널 </li><li> 20K + 에탄올 직접 GIRK 채널을 활성화 100 MM의 EtOH를 포함하는 욕실 솔루션 </li></ul> 플레이스 목욕 솔루션의 신속한 교환 재관류 시스템의 주사기 (솔루션 용기)에. 참고 : 우리는 목욕 솔루션을 제어하는​​ 워너 핀치 밸브 시스템을 사용합니다. PE 관을 권장합니다. 내부 / 전극 솔루션 : 140 MM KCl, 20 MM NaCl, 5 MM EGTA, 5.4 MM MgCl 2, 2.5 MM K 2 ATP 및 0.3 μm의 리튬이 GTP 10 MM HEPES (pH는 7.4). 우리는 ATP와 GTP없이 전극 솔루션을합니다. 우리는 개별적으로 -80 ° C에 저장되어있는 ATP와 GTP의 aliquots, 준비 및 실험 당일에 전극 솔루션에 추가할 수 있습니다. 우리는 ATP / GTP을 유지하기 위해 얼음 최종 전극 솔루션 주사기를 유지. 우리는 살균 필터 (0.2 μm의) 내부 / 외부 솔루션은 미생물 성장을 억제하고 튜브를 경화를 일으키는 가능성과 전극을 줄일 수 있습니다. 4.2 풀링 전극 우리는 세포 솔루션으로 가득 저항 MΩ 3-7로 전극을 얻기 위해 Narishige 두 단계 수직 풀러와 워너 악기 (1.5 mm 외경, 0.86 mm 내경과 7.5 cm의 길이)에서 borosilicate 유리 전극을 사용합니다. 참고 :이 실험적으로 귀하의 연구실에있는 전극 풀러와 전극 유리의 종류에 대한 매개 변수를 결정하기 위해 필요합니다. 우리 수직 풀러 위해, 우리는 두 번째 당기의 첫 번째 뽑아 ~ 43에 대해 60.2의 열 설정을 사용합니다. 클램핑 4.3 전체 세포 패치 <ol><li> 거꾸로 형광 현미경의 무대에서 외부 솔루션과 장소 요리와 커버, 바셀린의 소량을 사용하여 35mm 접시에 용지를 커버 마운트합니다. 세포를 집중하고 찾을 수 DIC 사용 YFP 긍정적인 세포를 찾을 수 형광 YFP로 전환합니다. </li><li> 녹색 셀 (간격 관심 = 2-3 셀 길이의 셀 20-30 μm의) 근처 재관류 매니폴드의 위치 팁. </li><li> 게인 1, 구성 : 전체 세포 β = 1, 모드 V - 클램프 솔루션 전극을 채우기 다음과 같은 초기 설정으로 Axopatch 200B 앰프의 headstage (액슨 악기)에 첨부합니다. </li><li> 피펫의 막히는 것을 방지하고, 그냥 셀 위에 전극 팁 곳으로 조작하는 사람을 사용하여 전극에 대한 긍정적인 압력을 적용합니다. </li><li> 피펫의 가능성을 제로, 테스트 전압 단계를 제공하기 위해 인감 테스트 버튼을 선택합니다. 5 MV 직사각형 전압 단계 Clampex의 인감 테스트 창에 나타납니다. 0 NA 현재의 기본 라인을 가지고 앰프에 피펫 오프셋 전위차를 조정합니다. 또는, V 트랙 모드와 "0.00"로 앰프 미터 디스플레이에 전압을 제공할 수 앰프에 피펫 오프셋 전위차를 Vtrack 사용하는 미터 노브로 선택기 앰프 모드를 전환하여 피펫의 가능성을 제로. </li><li> Clampex 8.2 소프트웨어 (MΩ 3-7한다)의 인감 테스트 명령을 사용하여 전극의 저항을 확인하십시오. </li><li> 저장된 프로토콜 파일을 열거나 새로운 프로토콜을 만들 수 있습니다. 프로토콜 파일을 열려면 주 메뉴에서 선택한 다음 열기 프로토콜을 습득하고 저장된 전압 프로토콜 파일을 선택합니다. 본 실험의 경우, 프로토콜 2 이상 40 뮤직 비디오로 -100 뮤직 비디오와 진입로로 한 50 MS 전압 단계를 제공합니다, - 40mV에서 막 잠재력을 보유하기 위해 만들어졌습니다00 MS. 이 프로토콜은 매 2 초 실행됩니다. 램프 프로토콜 GIRK 채널의 반전 잠재력과 내향 정류 관찰을 허용합니다. 전압 - 게이 티드 이온 채널에 대한, 직사각형 전압 단계는 더 적절할 수 있습니다. </li><li> 조작하는 사람의 미세한 조절을 사용하여 접근 세포는 긍정적인 압력을 풀어 세포 표면을 만져 후 부정적인 압력을 적용하고, 인감 테스트 오실로 스코프 윈도우에서 저항의 증가를 모니터링합니다. 일단 저항이 GΩ 범위에, 전극은 멤브레인 (Gigaseal가 형성 하였다)에 봉인했습니다. </li><li> 세포막을 아프게하고 셀에 대한 액세스를 얻을 부정적인 압력의 펄스를 적용합니다. 일단 전체 셀 구성에서, 당신은 등록 용량성 전류를 증가합니다. </li><li> Clampex에서 막 테스트로 전환하여 접근 저항 라, 멤브레인 저항 RM, 막 커패시턴스 CM을 작성하고 눈 실제 capacitative 현재에 대한 이론 곡선의 기하 급수적인 맞지로 확인합니다. 멤브레인 커패시턴스는 셀 크기에 비례하고 전류 밀도를 계산하기 위해 나중에 사용됩니다. </li><li> 10 kHz에서시 -40 뮤직 비디오와 필터 V - 아웃 (막 잠재력)을 설정 테스트를 봉쇄로 다시 전환 </li><li> 다음 단계로 앰프에 막 커패시턴스와 직렬 저항 보상 : <ol class="lalpha"><li> 에 전체가 CELL 캡 스위치를 전환합니다. 당신은 평면 테스트 펄스를 얻을 때까지 앞뒤로 완전 세포 CAP와 직렬 저항의 다이얼을 조정하십시오. 당신은 또한 피펫의 용량 FAST CAP 손잡이를 조정해야 할 수도 있습니다. </li><li> 60-80 % 정도로 %의 예측 손잡이를 켜고, 다시 재 조정 완전 세포 CAP 및 직렬 저항 다이얼을 (당신이 피펫 커패시턴스 보상 FAST 뚜껑 손잡이로 잘 조정해야 할 수도 있습니다.) </li><li> 다시 조정 완전 세포 CAP 및 직렬 저항 (이 피펫 커패시턴스 보상 FAST CAP 손잡이로 잘 조정해야 할 수도 있습니다)에 의해 펄스가 평평하게 유지하는 동안, 세포를 진동하지 않고 % 광고 - 100 %를 켭니다. 시간이 지속 감소하여 지연을 조정합니다. </li><li> CM (멤브레인 용량), RS (직렬 저항), %의 광고에 대한 값을 적어 %는 PRED 및 지연 시간은 노트북의 앰프에 설정합니다. CM 및 RS 위의 멤브레인 테스트에서 측정 CM과 RM과 같은 거의 동일해야합니다. </li></ol></li><li> 목욕 솔루션을 제어하는​​ 외부 솔루션 밸브를 켭니다. 2kHz로 앰프 8 폴 베셀 필터를 설정 전압 클램프 프로토콜을 열고 녹음 전류를 시작합니다. </li><li> 우리는 100 MV 200 MS 이상 40 MV 50 MS 다음 경사로를위한 -100 MV 단계와 매 2 초 전달 램프 프로토콜을 사용 GIRK 전류를 기록합니다. 램프 프로토콜은 반전 가능성의 관찰과 GIRK 채널의 안쪽 정류 속성에 대한 수 있습니다. 상온에서 (22-25 ° C), 현재 GIRK 근처 K (E K = -50 MV)에 대한 계산 평형 잠재력 가까이 -50 MV을 (목욕탕에서 20 밀리미터의 KCl과), 반대한다, 그때 남아 E K 긍정적인 잠재력에 상당히 평면. </li><li> 실험 프로토콜 : 안정 기준을 녹화 후, + Carbachol 솔루션 20K로 전환하고 20K 목욕 솔루션으로 전환, 응답의 최대 기다리는 다음, 20K 이상의 에탄올을 적용하고 최대 응답을 기다 후 20K 목욕 솔루션으로 전환하고, 마지막으로 20K + 바 2 + 솔루션입니다. 이러한 약물의 응용 프로그램을하는 동안 당신은 GIRK 조류 (대부분 -100 뮤직 비디오에서 발음)의 진폭의 변화를 볼 수 있습니다. 노트북 다른 세포 솔루션의 응용 프로그램에 해당하는 추적 번호를 적어 둡니다. 단일 Clampfit 파일은 전체 실험에​​ 대한 감시 장치를 모두 포함됩니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 우리는 -100 뮤직 비디오에서 데이터를 GIRK 전류를 분석 Clampfit 9.2 소프트웨어를 사용합니다. <ol><li> , 녹음과 파일을 열고 -100 MV에서 커서를 설정합니다. 기본적으로 당신은 화면에 중첩의 모든 흔적을 볼 수 있습니다. "커서 쓰기"아이콘을 누르면 당신은 수치 데이터를 엑셀과 같은 스프레드 시트를 생성합니다. </li><li> 할당 X으로 추적 번호 열 및 커서 컬럼에 Y로하고 빠르게 실험 시간 코스 계획을 그릴 수있는 "그래프 만들기"아이콘을 누르면. </li><li> + 혼자 외부 재관류 솔루션 ( "20K 현재"마이너스 "20K + 바 2 + 전류")에 기록된 현재의 바 2 면전에서 현재 빼서의 기저 전류를 계산합니다. 활성 전류에서 20K의 기저 전류를 빼서하여 유도 전류를 계산 ( "20K + Carbachol 현재"마이너스 "20K 현재"; "20K + 에탄올 현재"마이너스 "20K 현재"). 멤브레인 커패시턴스 (앰프에서 직접 읽어)에 의해 전류를 나누어 전류 밀도 (PA / PF)을 계산합니다. 기초 전류에 의해 유도 전류를 나누어 100으로 곱하여 %의 정품 인증을 계산합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 당신은 야생 타입 채널 transfected 세포에서 현재 레코드 수 있어야합니다. GIRK 채널 측정을위한20 MM을 포함하는 세포외 용액에 D K + (K + 세포와 145 ㎜)들은 강한 내면 정류 및 칼륨 채널의 필수 속성입니다 ~ -50 뮤직 비디오의 반전 가능성을 전시한다. 야생 형 전류 carbachol 응용 프로그램 (기초 전류 이상 3-5 배 증가)에 따라 강력하게 증가하고 100 MM 에탄올에 유사하게 반응합니다. 참고 : 전기 생리학을위한 서명 대회 그 안으로 현재는 부정되고 외부 전류가 긍정적입니다. GIRK2의 알코올 바인딩 주머니에 L257W 돌연변이 들어, carbachol과 에탄올 모두 감쇠 응답을 볼 수 있습니다. 이것은 L257이 알콜과 GIRK2 채널의 G 단백질 활성화에 관여 제안합니다. GIRK2 돌연변이 유발의 결과에 대한 예제를 보려면 Aryal 외에 의해 최근에 게시를 참조하십시오. 1. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 야생 형 GIRK2 기록에 대한 Clampfit 8.0 보여주는 데이터 파일의 창. 왼쪽 상단에 패널이 겹쳐 다른 바하 외부 솔루션의 존재에 램프 전압 프로토콜에 대한 응답으로 기록 지나간다 보여줍니다. 커서 1 -100 뮤직 비디오에 배치됩니다. 커서 값은 스프레드 시트 (오른쪽 패널)에 기록됩니다. 왼쪽 하단 패널은 스위프 수와, 현재의 줄거리를 보여줍니다. 에탄올 (EtOH)와 carbachol (수화물)과 바 2 +와 현재의 억제와 전류의 증가 (아래 편향)을합니다. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 돌연변 GIRK2 - L257W 녹음 Clampfit 8.0 보여주는 데이터 파일의 창. 설명은 그림 1에서와 같이 동일합니다. carbachol (수화물) 활성화 및 돌연변이 채널에 EtOH - 유도 전류의 감소의 손실을합니다.

<ol><li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li>
<li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K%2B+channels+examined+by+scanning+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Phys%22%5BJournal%5D)">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li>
<li>Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+potassium+channel%3A+molecular+basis+of+K%2B+conduction+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li>
<li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li>
<li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K%2B+channel+Kir2.2+at+3.1+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

사이트 이동 돌연변이 유발이 이온 채널의 구조 - 기능 관계를 연구하는 고전적인 접근이다. 이것은 이온 채널의 중요한 성분을 변경하여 하나는 채널 기능의 발음 변화를 관찰할 수 있어야 전제에 기초하고있다. 반면, 중요하지 않은 위치에 많은 변이는 채널 기능 주요 perturbations하지 않고 도입하실 수 있습니다. 일반적으로, 문제의 찌꺼기 먼저 알라닌, 트립토판, 2 아미노산의 가장 큰에 돌연변이 다음 작은 비 극성 아미노산에 변이이다. 잔여물은 채널 기능에 중요하다면, 모두 돌연변이 채널의 활동을 변경합니다. 덜 필수 물질 변이된 경우, 돌연변이, 특히 알라닌에의 영향은 종종 unremarkable 있습니다. 트립토판의 돌연변이 트립토판의 크기와 관련된 steric hindrances에 의한 변화를 일으킬 가능성이 더 높습니다. 종종 채널 (알라닌이나 트립토판 스캔라고도 함)의 조각 내에서 알라닌이나 트립토판에 대한 구조적 정보가 부족이며, 체계적인 돌연변이가 중요한 잔류물을 찾습니다하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 지점의 돌연변이와 함께 여러 클론을 병렬 비교적 짧은 시간 내에 여러 잔류물을 테스트하기 위해 허용으로 준비할 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 최근 채널의 여러 크리스탈 구조는 3,4,5 사용할 수 있습니다. 그들은이 프로토콜에서 설명한 방법을 사용하여 테스트하는 잠재적인 주요 잔류물을 제안하는 데 사용할 수 있습니다. 야생 형 채널에 측정은 항상 transfection 및 electrophysiological 실험이 제대로 것을 보증하기위한 긍정적인 제어 역할을하는 돌연변이 채널의 측정을 동반해야합니다. 포인트 돌연변 기능 현재의 부족, 채널 활동의 야생 입력하거나 변경 규정에 현재와 유사한 발생할 수 있습니다. 측정 전류의 부족은 부적 절한 접는 또는 변경 인신 매매로 인해 수 있습니다. 이러한 경우에는 그것은 채널 biotinylation 분석이나 플라즈마 막과 세포 내부의 보관 채널에서 동작하지 않음 채널 구분하는 세포 태그에 대한 immunofluorescence 얼룩을 (세포 permeabilization 제외)를 사용하여 표면에 정확하게 traffics 여부를 확인하는 것이 유용할 수 있습니다 . 마지막으로, 그것은 채널뿐만 아니라 채널 규정에 돌연변이의 결과의 기초 활동뿐 아니라 조사하는 것이 좋습니다. 채널 기능의 변조의 서로 다른 메커니즘은 G 단백질, PIP2, 이온, ATP 농도, 인산화 (티로신, 세린이나 트레오닌 돌연변를 사용하여), ubiquitination 또는 sumoylation (라이신 돌연변를 사용)에 의해 규제를 포함하여 관심의 이온 채널에 따라 연구 수 직접 채널 openers 또는 차단기.

<table><tbody><tr><td>화학 물질</td><td>시그마</td><td>다양함</td><td></td></tr><tr><td>미니 프렙 키트</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Radiacwash</td><td>Biodex</td><td>005-100</td><td></td></tr><tr><td>폴리-D-라이신 하이드로브로마이드</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40210</td><td>Poly-L-lysine 또한 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Maxi Prep 키트</td><td>Qiagen</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td><td>Stratagene</td><td>200512-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>커버글라스 &amp;#710;&amp;#8230; 12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-12R</td><td></td></tr><tr><td>모세관 유리 튜브 붕규산염-표준 벽 두께</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="blank"&gt;도립 형광 현미경&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leica</a></td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>전기생리학</td><td>Nikon/&lt;br/&gt;Leica/&lt;br/&gt;Zeiss</td><td>모든 도립 DIC 현미경&lt;br/&gt;(Hoffmann)&lt;br/&gt;형광 현미경</td><td></td></tr><tr><td>증폭기</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B 증폭기</td><td></td></tr><tr><td>관류 시스템</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 관류 MM-6</td><td></td></tr><tr><td>디지타이저</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1320 디지타이저</td><td></td></tr><tr><td>조작기</td><td>Sutter Instruments</td><td>조작기: MP-85</td><td></td></tr><tr><td>전극 인장기</td><td>Narishige</td><td>PC10 수직 전극 풀러</td><td></td></tr><tr><td>분리 표</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>에어 테이블</td><td></td></tr></tbody></table>

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 heterologously 포유 동물 세포에 표현

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

우리는 이온 채널의 포인트 변이를 도입의 기능 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 우리는 뉴런의 흥분을 규제에 대한 중요한 G 단백질 문이 안쪽으로 정류 칼륨 (GIRK라고도 함) 채널을 공부합니다. 네 가지 포유 동물 GIRK 채널 subunits은 (GIRK1 - GIRK4)이 있습니다 - 그것은 homotetramer을 형성하기 때문에 우리는 GIRK2에 중점을두고 있습니다. 같은 muscarinic 수용체 (M2R)로 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs), 다양한 종류의 자극은 GIRK 채널의 활성화로 연결됩니다. 알코올은 또한 직접 GIRK 채널을 활성화한다. 우리는 특별히 GIRK 채널에 대한 cDNA에서 하나 이상의 세포핵을 변경하여 한 아미노산을 공격하는 방법을 보여줍니다. 이 변이된 cDNA 시퀀스는 정화, 박테리아 증폭되며, 포인트 변이의 존재는 DNA 시퀀싱에 의해 확인됩니다. 변이 및 야생 형 GIRK 채널 cDNAs은 체외에서 배양해 인간 배아 신장 세포에 HEK293T transfected 것입니다. 마지막으로, 전체 세포 패치 - 클램프 전기 생리학은 ectopically 표현 야생 형 또는 변이 GIRK 채널을 통해 매크로 칼륨 전류를 연구하는 데 사용됩니다. 본 실험에서는, 우리는 M2R - 의존과 알코올 의존 활성화에 GIRK2 채널 L257W 돌연변이의 효과를 검사합니다.

우리는 이온 채널의 기능에 대한 단일 지점에서 돌연변이의 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

이온 채널에 점 돌연변이를 도입했을 때의 기능적 영향을 연구하는 방법을 시연하겠습니다. 본 연구에서는 G 단백질 작동성 내향 정류...

G-단백질 게이트 내향 정류성 칼륨 채널 또는 GIRK는 뉴런의 흥분성을 조절하는 데 중요합니다. GIRK는 무스카린 수용체 M₂R과 같은 G-단백질 결합 수용체(GPCR)와 알코올 모두에 의해 활성화될 수 있으며, GIRK 알코올 결합 부위의 돌연변이 효과를 연구할 수 있습니다. 활성화 시, 부위 특이적 돌연변이 유발법을 통해 GIRK cDNA에 단일 염기 돌연변이를 도입하며, 정제된 GIRK 작제물을 YFP 작제물과 함께 포유류 세포에 형질전환하고 형광 이미징을 통해 형질전환 효율을 평가합니다.그 다음, 알코올 및 G-단백질 의존적 활성화를 비교하기 위해 전체 세포 패치 클램프 분석을 수행합니다. 이 시각적 실험 시연은 LY 채널의 기능을 연구하는 방법에 대한 핵심 정보를 제공할 것입니다. 오늘은 알코올이 어떻게 그룹 채널을 활성화하는지에 대한 질문을 살펴보겠습니다.여기에서 보여주는 부위 특이적 신생(site directed neogenesis) 기법은 이온 통로 기능에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이 기법은 유전자 돌연변이가 인간 질병을 유발하는 것으로 알려진 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이것은 핫 셀 패치 클램핑(hot cell patch clamping) 기술의 시연입니다. 사용 가능한 데이터를 생성하기 위해서는 정밀함, 적절한 전자적 보정 및 숙련도가 필요한 단계가 많으므로 이 기술은 매우 중요합니다.본 프로토콜의 형질전환에 사용되는 DNA는 다음과 같이 준비합니다. 먼저, PCR을 통해 얻은 GRK 서브유닛 DNA를 포유류 발현 벡터로 직접 클로닝합니다. Plasmid PC DNA 3.1의 점 돌연변이는 QuickChange XL II site-directed mutagenesis kit와 적절하게 설계된 프라이머를 사용하여 도입합니다.이 시스템을 사용하여 전체 플라스미드가 복제되고 프라이머에 의해 인코딩된 점 돌연변이가 도입되는 PCR을 수행합니다. PCR 이후, 복제된 플라스미드를 DPN one 제한효소로 처리하여 분해한 다음, 열 충격법(heat shock)을 통해 XL 10 gold ultra competent e coli에 형질전환시킵니다. 형질전환된 박테리아를 ampicillin이 포함된 LB agar 플레이트에서 배양하면, 플라스미드를 보유한 박테리아는 ampicillin 내성을 가지게 되어 콜로니를 형성하게 됩니다.분리된 콜로니를 픽업하여 미니 배양(mini culture)에서 배양합니다. 플라스미드 DNA를 분리하기 위해 미니 프렙(mini prep)을 수행합니다. 그 후 DNA 서열 분석을 통해 돌연변이체가 성공적으로 형질전환되었는지 확인합니다.E coli를 대량으로 배양하고 맥시프렙(maxi prep)을 수행하여 더 많은 양의 플라스미드 DNA를 준비합니다. 12웰 플레이트의 두 개 웰에 각각 약 1×10⁵개의 HEK 293T 세포를 분주합니다. 하나는 돌연변이체용, 다른 하나는 대조군인 야생형 채널용입니다. 37°C에서 배양합니다.8~24시간 후, 세포가 기질에 부착되면 형질전환을 수행할 준비가 됩니다. 제조사의 지침에 따라 0.2 µg의 channel CDNA, 0.4 µg의 M two R receptor CDNA 및 0.04 µg의 Y-F-P-C-D-N-A를 lipo 2000으로 세포에 형질전환합니다. 형질전환이 성공적으로 이루어진 세포를 확인하기 위해 세포를 24시간 동안 배양합니다.원하는 배양 시간이 지난 후, 세포를 도립 형광 현미경의 스테이지 위에 올려 트랜스펙션 효율을 측정합니다. 형광 이미지와 DIC 이미지를 비교하여 트랜스펙션된 세포의 비율을 결정합니다. 배양 접시를 다시 인큐베이터로 옮깁니다.12 millimeter 유리 커버슬립을 세척하고 사용 전까지 에탄올에 보관하십시오. 멸균 캐비닛 내에서 화염 멸균하여 잔류 에탄올을 제거하십시오. 커버슬립을 24 well 플레이트에 넣고 0.2 milligrams per milliliter로 코팅하십시오.트랜스펙션 24시간 후 poly-D-lysine으로 코팅하고 트립신으로 세포를 떼어내어 웰당 4×10³개의 세포를 분주합니다. poly-D-lysine이 코팅된 유리 커버슬립이 포함된 24웰 플레이트의 4~8개 웰에서 whole-cell 패치 클램핑을 수행하기 전 24~48시간 동안 추가로 배양합니다. 2단계 수직 풀러와 붕규산염 전극 유리를 사용하여 패치 전극을 준비합니다.이상적으로 완성된 전극은 3~7 MΩ의 저항값을 가져야 하며, 열 연마와 같은 추가적인 조작이 필요하지 않아야 합니다. 패치 클램핑을 위해, 20 mM potassium 또는 20 K 외부 용액이 들어 있는 35 mm 디시에 형질전환된 세포가 있는 커버슬립을 넣습니다. 이 디시를 도립 형광 현미경의 스테이지 위에 놓습니다.여기서 사용된 패치 클램핑 설정은 관류 시스템을 이용합니다. 이 시스템은 세포에 적용될 세포외 용액들을 포함하고 있으며, 이 용액들은 매니폴드에 연결된 튜브를 통해 중력식으로 공급됩니다. 각 용액은 솔레노이드 핀치 밸브를 통해 원격으로 제어됩니다.DIC를 사용하여 초점을 맞추고 세포를 찾습니다. YFP 필터로 전환하여 YFP 양성 세포의 위치를 확인합니다. YFP 양성 세포가 확인되면, 관류 시스템의 팁을 신경 형광 세포로부터 20 to 30 microns 또는 세포 2~3개 길이만큼 떨어진 곳에 배치합니다.전극을 내부 전극 용액으로 채웁니다. 주사기와 유연한 바늘을 사용하여, 채워진 전극을 가볍게 쳐서 팁 부분의 기포를 제거합니다. 전극을 AXO patch 200 B 증폭기의 헤드 스테이지에 연결합니다.증폭기의 설정이 한 가지 구성과 일치하는지 다시 확인하십시오. Whole cell 스위치는 beta=1로, 저역 통과 필터(lowpass vessel filter)는 10 kHz로 설정합니다. 시린지와 클램프를 사용하여 양압을 가해 전극 팁을 깨끗하게 유지하십시오.그다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극의 팁을 배스(bath)에 넣고 세포 위로 이동시킵니다. 앰플리파이어를 V track 모드로 전환하고 미터 노브를 V track으로 맞춥니다. 그런 다음 앰플리파이어의 피펫 오프셋 전위 미터를 사용하여 앰플리파이어 미터 디스플레이의 전압을 0.00으로 맞춤으로써 피펫 전위를 0으로 조정합니다.또는, 앰플리파이어를 V clamp 모드로 전환하고 테스트 펄스 버튼을 선택하여 테스트 전압 스텝을 가합니다. 직사각형 전압 스텝이 clamp의 씰 테스트 창에 나타납니다. 앰플리파이어의 피펫 오프셋을 조절하여 기선 전류를 0 nA로 맞춥니다.씰 테스트를 통해 전극 저항을 확인할 수 있으며, 이는 3~7 MΩ이어야 합니다. 다음으로 씰 테스트 창을 닫으십시오. 드롭다운 메뉴에서 acquire open protocol을 선택하십시오.그 다음 저장된 전압 프로토콜을 선택합니다. 여기서는 -100 millivolts의 단일 전압 단계를 전달하고 2초마다 +40 millivolts까지 램프(ramp)하도록 미리 프로그래밍된 프로토콜을 선택했습니다. 이러한 램프 프로토콜을 통해 역전 전위와 GK 채널의 내향 정류 특성을 관찰할 수 있습니다.전압 개폐성 이온 채널의 경우 직사각형 전압 단계가 더 적절할 수 있습니다. 마이크로 조작기의 미세 조정 기능을 사용하여 세포에 접근한 뒤 양압을 해제하고, 세포 표면에 닿으면 약간의 음압을 가합니다. 실 씰(seal) 테스트에서 그 결과로 발생하는 저항의 증가를 모니터링하십시오. 저항이 기가옴(giga ohm) 범위에 도달하면 전극이 막에 밀폐된 것입니다.이를 기가씰(giga seal)이라고 합니다. 시린지를 사용하여 음압 펄스를 가해 세포막을 파열시키고 세포 내부로 접근합니다. 전세포-기록(whole cell configuration) 상태가 되면, 씰 테스트 시 테스트의 시작과 끝부분에서 스파이크 또는 일시적 현상으로 나타나는 큰 정전 용량 전류가 기록됩니다.밀봉 테스트를 위해 펄스를 줍니다. 다음으로, 막 테스트(membrane test) 버튼을 클릭하십시오. 클램프 X에서 접근 저항과 막 저항을 기록합니다.노트북에 기록된 막 커패시턴스를 통해 지수 함수적 적합성을 육안으로 확인합니다. 막 커패시턴스는 세포 크기에 비례하며, 전류 밀도를 계산하는 데 사용됩니다. 접근 저항과 막 저항은 기록 상태가 계속 진행하기에 적절한지 평가하는 데 사용됩니다.좋은 기록을 위해서는 접근 저항(access resistance)이 낮아야 합니다. 이제 막(membrane) 테스트 창을 닫고 씰(seal) 테스트 창에서 씰 테스트 버튼을 다시 클릭하십시오. 앰플리파이어의 막 정전용량(membrane capacitance)과 직렬 저항을 보정하기 위해 V out을 -40 mV로 설정하고, 전세포 정전용량(whole cell cap) 스위치를 켭니다. 과도 응답(transient)이 최소화되고 전류가 평탄한 직선이 될 때까지 전세포 정전용량과 직렬 저항을 조절하십시오. 필요한 경우, 앰플리파이어의 fast cap 노브를 사용하여 피펫 정전용량을 조절하십시오.보정값이 너무 많거나 적으면 잔류 용량 과도 현상이 발생합니다. 다음으로 퍼센트 예측 노브를 60에서 80%로 돌리고, 씰 테스트에서 평탄한 선이 나타나도록 전체 세포 정전용량(whole cell cap), 직렬 저항(series resistance) 및 고속 정전용량(fast cap)을 필요에 따라 재조정하십시오. 마지막으로, 전체 세포 정전용량, 직렬 저항 및 고속 정전용량 포텐셔미터를 재조정하여 펄스가 최대한 선형적으로 유지되도록 노력하면서, 세포에 진동이 발생하지 않도록 퍼센트 보정값을 약 100%로 돌리십시오.저항 및 정전용량 보정이 완료되면, 앰플리파이어 정전용량 직렬 저항 백분율, 보정 백분율 예측값 및 지연 시간을 노트북에 기록하고, 제어용 20 K bath 용액의 외부 용액 밸브를 엽니다. 앰플리파이어의 저역 통과 용기 필터(lowpass vessel filter)를 2 kHz로 설정하십시오. 그런 다음 소프트웨어의 기록 버튼을 클릭하여 전류 기록을 시작합니다.GER 전류의 내향 정류 특성을 확인하십시오. 이는 Nernst 식 EK로 결정되는 칼륨 역전 전위보다 음수 값에서 나타나는 큰 내향 전류와 EK보다 양수 값에서 나타나는 작은 외향 전류로 관찰됩니다. 안정적인 기선(baseline)을 기록한 후, extracellular solution 20 k plus carbahol을 처리하여 수용체 매개 전류 활성화를 결정하십시오.최대 활성화가 관찰되고 전류가 정상 상태에 도달하면, 다시 K bath 용액으로 전환하고 기선 전류 수준에 도달할 때까지 기다립니다. 다음으로 알코올에 의한 gert 전류 활성화를 연구하기 위해, 20 k plus 100 millimolar ethanol 외부 용액으로 전환하고 최대 반응이 나타날 때까지 기다립니다.그다음 20 K 배스 용액으로 다시 전환하고 기선 전류 수준에 도달할 때까지 기다립니다. 마지막으로, 기저 gerk 전류를 결정하기 위해 20 K에 20 K 바륨이 추가된 용액으로 전환하고 여기서의 반응을 기다립니다. gerk 전류의 억제는 전체 과정 동안 -100 mV에서 가장 뚜렷하게 나타나야 합니다.서로 다른 세포 외 용액의 적용에 해당하는 트레이스 스윕 번호를 확인하십시오. 단일 clamp fit 파일에는 전체 실험의 모든 스윕이 포함됩니다. GK 데이터를 분석하려면 clamp FIT 8.2 소프트웨어를 사용하십시오.함께 제공된 서면 프로토콜의 지침에 따라, 야생형 또는 돌연변이 GK 채널을 발현하는 HEC 2 9 3 T 세포로부터 두 가지 서로 다른 전체 기록을 얻었으며, 여기 야생형 GK 2에서 보여주는 것과 같이 이 비디오의 지침에 따라 분석하였습니다. 왼쪽 패널에는 서로 다른 용액의 존재 하에 전압 램프 프로토콜에 의해 생성된 여러 중첩 전류가 포함된 창이 있습니다. 내향 정류 현상에 주목하십시오.이는 전류 트레이스의 약 50밀리초 지점에서 -100밀리볼트일 때 나타나는 더 큰 내향 전류입니다. 전류 트레이스의 약 200에서 260밀리초 사이, 0에서 +40밀리볼트 사이에서 나타나는 작은 외향 전류는 내인성 전압 개폐 포타슘 채널에서 유래한 것입니다. 이는 Gert 전류 커서가 아닙니다.하나를 최대 내향 전류 지점에 배치하고, 커서 값을 스프레드시트에 기록합니다. 스프레드시트에서 트레이스 번호와 -100 mV에서의 전류를 확인할 수 있습니다.데이터에는 기저 전류, carbahol 유도 전류 및 알코올 유발 전류와 barium 억제 전류가 포함되어 있습니다. 마찬가지로, 서로 다른 용액이 존재할 때의 전압 램프 전류가 포함됩니다. 돌연변이 채널 L 2 57 w에 대해 20 k plus 100 millimolar ethanol, 20 k plus five millimolar carbahol 또는 20 k plus barium의 결과가 나타나 있습니다.알코올 및 카보알코올(carbo alcohol)에 의해 유도된 전류가 현저히 작다는 점에 주목하십시오. 이러한 결과는 이 잔기가 알코올 및 g 베타 감마(g beta gamma) 소단위체에 의한 GK 채널의 게이팅(gating)에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 이 영상을 시청한 후에는 돌연변이를 구축하고 고급 전기생리학적 기법을 사용하여 채널 기능에 미치는 영향을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 기법에 숙달되면, 이 부위 지정 신생합성(site directed neogenesis) 기술은 2~3일 만에 완료할 수 있으며 5개 이상의 돌연변이까지 확장 가능합니다. 이러한 기술의 발전은 이온 채널 생물물리학자들이 이온 채널 기능과 게이팅(gating)의 기본 특성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 또한, 연구자들이 이온 채널 유전자의 단일 돌연변이로 인해 발생하는 인간 질병을 연구할 수 있게 해줍니다.

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