이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

G-단백질 게이트 내향 정류성 칼륨 채널 또는 GIRK는 뉴런의 흥분성을 조절하는 데 중요합니다. GIRK는 무스카린 수용체 M₂R과 같은 G-단백질 결합 수용체(GPCR)와 알코올 모두에 의해 활성화될 수 있으며, GIRK 알코올 결합 부위의 돌연변이 효과를 연구할 수 있습니다. 활성화 시, 부위 특이적 돌연변이 유발법을 통해 GIRK cDNA에 단일 염기 돌연변이를 도입하며, 정제된 GIRK 작제물을 YFP 작제물과 함께 포유류 세포에 형질전환하고 형광 이미징을 통해 형질전환 효율을 평가합니다.

그 다음, 알코올 및 G-단백질 의존적 활성화를 비교하기 위해 전체 세포 패치 클램프 분석을 수행합니다. 이 시각적 실험 시연은 LY 채널의 기능을 연구하는 방법에 대한 핵심 정보를 제공할 것입니다. 오늘은 알코올이 어떻게 그룹 채널을 활성화하는지에 대한 질문을 살펴보겠습니다.

여기에서 보여주는 부위 특이적 신생(site directed neogenesis) 기법은 이온 통로 기능에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 이 기법은 유전자 돌연변이가 인간 질병을 유발하는 것으로 알려진 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이것은 핫 셀 패치 클램핑(hot cell patch clamping) 기술의 시연입니다. 사용 가능한 데이터를 생성하기 위해서는 정밀함, 적절한 전자적 보정 및 숙련도가 필요한 단계가 많으므로 이 기술은 매우 중요합니다.

본 프로토콜의 형질전환에 사용되는 DNA는 다음과 같이 준비합니다. 먼저, PCR을 통해 얻은 GRK 서브유닛 DNA를 포유류 발현 벡터로 직접 클로닝합니다. Plasmid PC DNA 3.1의 점 돌연변이는 QuickChange XL II site-directed mutagenesis kit와 적절하게 설계된 프라이머를 사용하여 도입합니다.

이 시스템을 사용하여 전체 플라스미드가 복제되고 프라이머에 의해 인코딩된 점 돌연변이가 도입되는 PCR을 수행합니다. PCR 이후, 복제된 플라스미드를 DPN one 제한효소로 처리하여 분해한 다음, 열 충격법(heat shock)을 통해 XL 10 gold ultra competent e coli에 형질전환시킵니다. 형질전환된 박테리아를 ampicillin이 포함된 LB agar 플레이트에서 배양하면, 플라스미드를 보유한 박테리아는 ampicillin 내성을 가지게 되어 콜로니를 형성하게 됩니다.

분리된 콜로니를 픽업하여 미니 배양(mini culture)에서 배양합니다. 플라스미드 DNA를 분리하기 위해 미니 프렙(mini prep)을 수행합니다. 그 후 DNA 서열 분석을 통해 돌연변이체가 성공적으로 형질전환되었는지 확인합니다.

E coli를 대량으로 배양하고 맥시프렙(maxi prep)을 수행하여 더 많은 양의 플라스미드 DNA를 준비합니다. 12웰 플레이트의 두 개 웰에 각각 약 1×10⁵개의 HEK 293T 세포를 분주합니다. 하나는 돌연변이체용, 다른 하나는 대조군인 야생형 채널용입니다. 37°C에서 배양합니다.

8~24시간 후, 세포가 기질에 부착되면 형질전환을 수행할 준비가 됩니다. 제조사의 지침에 따라 0.2 µg의 channel CDNA, 0.4 µg의 M two R receptor CDNA 및 0.04 µg의 Y-F-P-C-D-N-A를 lipo 2000으로 세포에 형질전환합니다. 형질전환이 성공적으로 이루어진 세포를 확인하기 위해 세포를 24시간 동안 배양합니다.

원하는 배양 시간이 지난 후, 세포를 도립 형광 현미경의 스테이지 위에 올려 트랜스펙션 효율을 측정합니다. 형광 이미지와 DIC 이미지를 비교하여 트랜스펙션된 세포의 비율을 결정합니다. 배양 접시를 다시 인큐베이터로 옮깁니다.

12 millimeter 유리 커버슬립을 세척하고 사용 전까지 에탄올에 보관하십시오. 멸균 캐비닛 내에서 화염 멸균하여 잔류 에탄올을 제거하십시오. 커버슬립을 24 well 플레이트에 넣고 0.2 milligrams per milliliter로 코팅하십시오.

트랜스펙션 24시간 후 poly-D-lysine으로 코팅하고 트립신으로 세포를 떼어내어 웰당 4×10³개의 세포를 분주합니다. poly-D-lysine이 코팅된 유리 커버슬립이 포함된 24웰 플레이트의 4~8개 웰에서 whole-cell 패치 클램핑을 수행하기 전 24~48시간 동안 추가로 배양합니다. 2단계 수직 풀러와 붕규산염 전극 유리를 사용하여 패치 전극을 준비합니다.

이상적으로 완성된 전극은 3~7 MΩ의 저항값을 가져야 하며, 열 연마와 같은 추가적인 조작이 필요하지 않아야 합니다. 패치 클램핑을 위해, 20 mM potassium 또는 20 K 외부 용액이 들어 있는 35 mm 디시에 형질전환된 세포가 있는 커버슬립을 넣습니다. 이 디시를 도립 형광 현미경의 스테이지 위에 놓습니다.

여기서 사용된 패치 클램핑 설정은 관류 시스템을 이용합니다. 이 시스템은 세포에 적용될 세포외 용액들을 포함하고 있으며, 이 용액들은 매니폴드에 연결된 튜브를 통해 중력식으로 공급됩니다. 각 용액은 솔레노이드 핀치 밸브를 통해 원격으로 제어됩니다.

DIC를 사용하여 초점을 맞추고 세포를 찾습니다. YFP 필터로 전환하여 YFP 양성 세포의 위치를 확인합니다. YFP 양성 세포가 확인되면, 관류 시스템의 팁을 신경 형광 세포로부터 20 to 30 microns 또는 세포 2~3개 길이만큼 떨어진 곳에 배치합니다.

전극을 내부 전극 용액으로 채웁니다. 주사기와 유연한 바늘을 사용하여, 채워진 전극을 가볍게 쳐서 팁 부분의 기포를 제거합니다. 전극을 AXO patch 200 B 증폭기의 헤드 스테이지에 연결합니다.

증폭기의 설정이 한 가지 구성과 일치하는지 다시 확인하십시오. Whole cell 스위치는 beta=1로, 저역 통과 필터(lowpass vessel filter)는 10 kHz로 설정합니다. 시린지와 클램프를 사용하여 양압을 가해 전극 팁을 깨끗하게 유지하십시오.

그다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극의 팁을 배스(bath)에 넣고 세포 위로 이동시킵니다. 앰플리파이어를 V track 모드로 전환하고 미터 노브를 V track으로 맞춥니다. 그런 다음 앰플리파이어의 피펫 오프셋 전위 미터를 사용하여 앰플리파이어 미터 디스플레이의 전압을 0.00으로 맞춤으로써 피펫 전위를 0으로 조정합니다.

또는, 앰플리파이어를 V clamp 모드로 전환하고 테스트 펄스 버튼을 선택하여 테스트 전압 스텝을 가합니다. 직사각형 전압 스텝이 clamp의 씰 테스트 창에 나타납니다. 앰플리파이어의 피펫 오프셋을 조절하여 기선 전류를 0 nA로 맞춥니다.

씰 테스트를 통해 전극 저항을 확인할 수 있으며, 이는 3~7 MΩ이어야 합니다. 다음으로 씰 테스트 창을 닫으십시오. 드롭다운 메뉴에서 acquire open protocol을 선택하십시오.

그 다음 저장된 전압 프로토콜을 선택합니다. 여기서는 -100 millivolts의 단일 전압 단계를 전달하고 2초마다 +40 millivolts까지 램프(ramp)하도록 미리 프로그래밍된 프로토콜을 선택했습니다. 이러한 램프 프로토콜을 통해 역전 전위와 GK 채널의 내향 정류 특성을 관찰할 수 있습니다.

전압 개폐성 이온 채널의 경우 직사각형 전압 단계가 더 적절할 수 있습니다. 마이크로 조작기의 미세 조정 기능을 사용하여 세포에 접근한 뒤 양압을 해제하고, 세포 표면에 닿으면 약간의 음압을 가합니다. 실 씰(seal) 테스트에서 그 결과로 발생하는 저항의 증가를 모니터링하십시오. 저항이 기가옴(giga ohm) 범위에 도달하면 전극이 막에 밀폐된 것입니다.

이를 기가씰(giga seal)이라고 합니다. 시린지를 사용하여 음압 펄스를 가해 세포막을 파열시키고 세포 내부로 접근합니다. 전세포-기록(whole cell configuration) 상태가 되면, 씰 테스트 시 테스트의 시작과 끝부분에서 스파이크 또는 일시적 현상으로 나타나는 큰 정전 용량 전류가 기록됩니다.

밀봉 테스트를 위해 펄스를 줍니다. 다음으로, 막 테스트(membrane test) 버튼을 클릭하십시오. 클램프 X에서 접근 저항과 막 저항을 기록합니다.

노트북에 기록된 막 커패시턴스를 통해 지수 함수적 적합성을 육안으로 확인합니다. 막 커패시턴스는 세포 크기에 비례하며, 전류 밀도를 계산하는 데 사용됩니다. 접근 저항과 막 저항은 기록 상태가 계속 진행하기에 적절한지 평가하는 데 사용됩니다.

좋은 기록을 위해서는 접근 저항(access resistance)이 낮아야 합니다. 이제 막(membrane) 테스트 창을 닫고 씰(seal) 테스트 창에서 씰 테스트 버튼을 다시 클릭하십시오. 앰플리파이어의 막 정전용량(membrane capacitance)과 직렬 저항을 보정하기 위해 V out을 -40 mV로 설정하고, 전세포 정전용량(whole cell cap) 스위치를 켭니다. 과도 응답(transient)이 최소화되고 전류가 평탄한 직선이 될 때까지 전세포 정전용량과 직렬 저항을 조절하십시오. 필요한 경우, 앰플리파이어의 fast cap 노브를 사용하여 피펫 정전용량을 조절하십시오.

보정값이 너무 많거나 적으면 잔류 용량 과도 현상이 발생합니다. 다음으로 퍼센트 예측 노브를 60에서 80%로 돌리고, 씰 테스트에서 평탄한 선이 나타나도록 전체 세포 정전용량(whole cell cap), 직렬 저항(series resistance) 및 고속 정전용량(fast cap)을 필요에 따라 재조정하십시오. 마지막으로, 전체 세포 정전용량, 직렬 저항 및 고속 정전용량 포텐셔미터를 재조정하여 펄스가 최대한 선형적으로 유지되도록 노력하면서, 세포에 진동이 발생하지 않도록 퍼센트 보정값을 약 100%로 돌리십시오.

저항 및 정전용량 보정이 완료되면, 앰플리파이어 정전용량 직렬 저항 백분율, 보정 백분율 예측값 및 지연 시간을 노트북에 기록하고, 제어용 20 K bath 용액의 외부 용액 밸브를 엽니다. 앰플리파이어의 저역 통과 용기 필터(lowpass vessel filter)를 2 kHz로 설정하십시오. 그런 다음 소프트웨어의 기록 버튼을 클릭하여 전류 기록을 시작합니다.

GER 전류의 내향 정류 특성을 확인하십시오. 이는 Nernst 식 EK로 결정되는 칼륨 역전 전위보다 음수 값에서 나타나는 큰 내향 전류와 EK보다 양수 값에서 나타나는 작은 외향 전류로 관찰됩니다. 안정적인 기선(baseline)을 기록한 후, extracellular solution 20 k plus carbahol을 처리하여 수용체 매개 전류 활성화를 결정하십시오.

최대 활성화가 관찰되고 전류가 정상 상태에 도달하면, 다시 K bath 용액으로 전환하고 기선 전류 수준에 도달할 때까지 기다립니다. 다음으로 알코올에 의한 gert 전류 활성화를 연구하기 위해, 20 k plus 100 millimolar ethanol 외부 용액으로 전환하고 최대 반응이 나타날 때까지 기다립니다.

그다음 20 K 배스 용액으로 다시 전환하고 기선 전류 수준에 도달할 때까지 기다립니다. 마지막으로, 기저 gerk 전류를 결정하기 위해 20 K에 20 K 바륨이 추가된 용액으로 전환하고 여기서의 반응을 기다립니다. gerk 전류의 억제는 전체 과정 동안 -100 mV에서 가장 뚜렷하게 나타나야 합니다.

서로 다른 세포 외 용액의 적용에 해당하는 트레이스 스윕 번호를 확인하십시오. 단일 clamp fit 파일에는 전체 실험의 모든 스윕이 포함됩니다. GK 데이터를 분석하려면 clamp FIT 8.2 소프트웨어를 사용하십시오.

함께 제공된 서면 프로토콜의 지침에 따라, 야생형 또는 돌연변이 GK 채널을 발현하는 HEC 2 9 3 T 세포로부터 두 가지 서로 다른 전체 기록을 얻었으며, 여기 야생형 GK 2에서 보여주는 것과 같이 이 비디오의 지침에 따라 분석하였습니다. 왼쪽 패널에는 서로 다른 용액의 존재 하에 전압 램프 프로토콜에 의해 생성된 여러 중첩 전류가 포함된 창이 있습니다. 내향 정류 현상에 주목하십시오.

이는 전류 트레이스의 약 50밀리초 지점에서 -100밀리볼트일 때 나타나는 더 큰 내향 전류입니다. 전류 트레이스의 약 200에서 260밀리초 사이, 0에서 +40밀리볼트 사이에서 나타나는 작은 외향 전류는 내인성 전압 개폐 포타슘 채널에서 유래한 것입니다. 이는 Gert 전류 커서가 아닙니다.

하나를 최대 내향 전류 지점에 배치하고, 커서 값을 스프레드시트에 기록합니다. 스프레드시트에서 트레이스 번호와 -100 mV에서의 전류를 확인할 수 있습니다.

데이터에는 기저 전류, carbahol 유도 전류 및 알코올 유발 전류와 barium 억제 전류가 포함되어 있습니다. 마찬가지로, 서로 다른 용액이 존재할 때의 전압 램프 전류가 포함됩니다. 돌연변이 채널 L 2 57 w에 대해 20 k plus 100 millimolar ethanol, 20 k plus five millimolar carbahol 또는 20 k plus barium의 결과가 나타나 있습니다.

알코올 및 카보알코올(carbo alcohol)에 의해 유도된 전류가 현저히 작다는 점에 주목하십시오. 이러한 결과는 이 잔기가 알코올 및 g 베타 감마(g beta gamma) 소단위체에 의한 GK 채널의 게이팅(gating)에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다. 이 영상을 시청한 후에는 돌연변이를 구축하고 고급 전기생리학적 기법을 사용하여 채널 기능에 미치는 영향을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 기법에 숙달되면, 이 부위 지정 신생합성(site directed neogenesis) 기술은 2~3일 만에 완료할 수 있으며 5개 이상의 돌연변이까지 확장 가능합니다. 이러한 기술의 발전은 이온 채널 생물물리학자들이 이온 채널 기능과 게이팅(gating)의 기본 특성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 또한, 연구자들이 이온 채널 유전자의 단일 돌연변이로 인해 발생하는 인간 질병을 연구할 수 있게 해줍니다.