Name: 트렌스 제닉 모기를 구하는 A. aegypti의 태아의 Microinjection (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 39 s
Description: 배우세요 Aedes aegypti 모기 배아에 대한 마이크로인젝션 기술을 통해 트랜스제닉 모기를 생성하는 방법을. 이 방법은 바이러스 매개체 제어와 유전학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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microinjection 사전에 준비 <ol><li> 혈액 공급 모기 : 월요일부터 목요일 이전 금요일 공급 여자에 분사하십시오. </li><li> 프로그램 3 2 (자료 참조)를 사용하여 유리 바늘을 준비합니다. </li><li> 배아의 튜브를 누워있는 것은 Drosophila 문화 약병입니다. 그것을 다루는 필터 종이 젖은 디스크와 함께 바닥에 젖은 탈지면. </li><li> 권력을 더블 사이드 테이프를 대고 비닐 커버 신청서를 준비합니다. 그것이 커버 슬립의 가장자리에 끝이 너무 커버하는 트림 테이프 이구요. </li><li> (자료 참조) 건조를 위해 기름을 준비 </li><li> 주사 후 배아를 유지하는 여과지 (80mm 왓먼)의 젖은 디스크로 덮인 바닥에 젖은 탈지면, 150 ML 플라스틱 비이커. </li></ol> 강제 부설의 설정 <ol><li> 흡인기를 이용하여 6-10 혈액 공급의 여자를 수집하고 서부 유럽 표준시 면화 및 필터 종이 Drosophila 문화 병을에게 전송할 수 있습니다. </li><li> 어둠 속에서 insectory 조건으로 다시 모기를 넣고 1 시간 및 15에 대한 알을 낳을 수 있습니다. </li><li> 성인 케이지로 비행하고 태아와 여과지 디스크를 제거하자. </li><li> 해부 현미경, 그래서 계란을 줄을 수 있습니다. 좋은 포셉 번호 5 벌금 페인트를 사용 darkish - 회색 배아에 회색 선택하고 물에 젖었 3MM 왓먼 용지의 광장에 일렬로 배열. 주사는 후부 기둥에 갈 수있는 것처럼 모든 배아가 같은 방향에 있어야합니다. 배아의 앞쪽에 끝이 뒷부분보다 약간 넓은 있습니다. (서부 유럽 표준시 것들이 테이프에 붙어되지 않습니다) 그것에 건조 여과지를 눌러 태아와 필터 종이를 건조시킵니다. , 계란을 전송 양면 테이프가 들어있는 슬라이드를 반전하고 부드럽게 달걀에 대한 키를 누릅니다. 계란의 뒷부분 끝 이중 양면 테이프의 가장자리에 아주 가까이해야합니다. </li><li> 1 분에 대한 배아를 마르다. 상온에서. 그들은 드라이로 그들은 약간 보조개로 시작합니다. </li><li> 더 탈수를 방지하기 위해 할로 카본 오일 desiccated 배아를 커버. </li></ol> 배아의 Microinjection <ol><li> 좋은 주입의 가장 중요한 부분은 (자료 참조) 바늘의 품질입니다. </li><li> microloader를 사용하여 주입하는 DNA 솔루션 바늘을 입력합니다. 거의 사출 솔루션이 필요합니다 : 1-2 μl합니다. </li><li> 사출 시간 (마누)과 압력 (600)를 제어 Transjector, 그리고 backpressure (250)에 바늘을 연결합니다. Microinjection은 X 10 배율과 micromanipulator에서 이동 무대 (Leica)와 현미경을 사용하여 수행됩니다. 필요한 경우, 제기 현미경 스테이지 4-5 현미경 슬라이드를 스태킹하여 준비 수 있습니다. 제기 무대에 배아를 가지고 커버 전표를 놓습니다. endochorion의 끊어지고 방지하기 위해 수평으로 배아를 주입, 보급률은 사후 극에서해야합니다. 주사, 그 바늘이 고정 유지하고 현미경의 단계로 이동합니다. </li><li> 배아 볼륨의 약 1-5%에 해당 솔루션의 0.2-0.5 NL을 주사. 사출 압력 및 시간을 조정하여 사출 볼륨을 제어합니다. 약간 숙이고, desiccated 배아들은 과장된 외관의 다음과 같은 사출을 회복해야합니다. </li><li> 벌금 포셉 또는 좋은 브러시를 사용하여 커버 슬립의 배아를 선택하고, 서부 유럽 표준시 면화으로 젖은 필터 종이와 플라스틱 비커에 넣습니다. 조직 종이로 비커를 커버. 테두리 탄성 밴드와 장소에 보관하고 4 일간 insectary 조건으로 돌아갑니다. </li></ol> 포스트 - 사출 <ol><li> 나흘 후, 음식의 작은 양의 큰 플라스틱 상자에 물을 조심스럽게 장소 배아 종이, 아래 배아 측. 배아는 매우 긴 기간 동안 부화 : 최소한 4-5주 사후 분사까지 문화를 던져하지 않습니다. </li></ol> 노트 주사에 대한 DNA 주사에 대한 플라스미드 DNA 솔루션은 EndoFree 플라스미드 키트를 사용하여 격리되었다. 구축 및 오른쪽 농도 함께 도우미 플라스미드 믹스, izopropanol 함께 시켰던. 펠렛은 사출 버퍼 resuspending하기 전에 70 % 에탄올로 씻은했다. 전에 주입, Millex - GV 칼럼을 사용하여 청소 DNA.

<table><tbody><tr><td>1x 주입 용액</td><td>완충액</td><td></td><td></td><td>5mM KCl, 0.1mM 인산나트륨, pH 6.8</td></tr><tr><td>컨스트럭트 플라스미드</td><td>DNA</td><td></td><td></td><td>0.5 mg/ml</td></tr><tr><td>헬퍼 플라스미드</td><td>DNA</td><td></td><td></td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>EndoFree 플라스미드 키트</td><td>키트</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV 컬럼</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>DNA 정제용</td></tr><tr><td>글라스 풀러</td><td>기기</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-87</td><td>Heat-815, Pull-10, Vel-10, Time-100. Heat-700, Pull-30, Vel-36, Time-50</td></tr><tr><td>쿼츠 풀러</td><td>기기</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Model P-2000</td><td>Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141</td></tr><tr><td>주입용 유리 바늘</td><td></td><td></td><td></td><td>마이크로피펫 풀러를 사용하여 모세관 튜브를 약 100-300 µm의 샤프트와 3-8 µm의 미세 팁으로 뽑아 제작함. 새 바늘의 경우 팁이 밀봉되어 있어 보통 첫 번째 또는 두 번째 주입 시 깨지며, Brown 타입 마이크로피펫 베벨러(Sutter Instrument)를 사용하여 유리 바늘 팁을 경사지게 깎을 수 있음.</td></tr><tr><td>Aedes aegypti</td><td>동물</td><td></td><td></td><td>배아 확보를 위한 암수 모기</td></tr><tr><td>초파리 배양 바이알</td><td></td><td></td><td></td><td>모기 산란용</td></tr><tr><td>할로카본 오일</td><td>시약</td><td></td><td></td><td>건조용 오일: Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1)</td></tr><tr><td>포셉 No5</td><td>도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세밀 붓</td><td></td><td>Kolinsky Sable</td><td>No. 0000</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 페이퍼</td><td>도구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로로더</td><td>도구</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>트랜스젝터</td><td>도구</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>이동식 스테이지 및 마이크로매니퓰레이터 포함</td></tr><tr><td>3MM Whatman 페이퍼</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

트렌스 제닉 모기를 구하는 a. aegypti의 태아의 microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

이 비디오에서는 Nijole Jasinskiene는 뎅그열 발열에 대한 벡터 아르 유전자 변형 Aedes aegypti 모기를 생성하기 위해 사용된 방법을 보여줍니다. 정확하게, microinjection의 바늘을 준비하는 배아를 d​​essicating, 그리고 microinjection을 수행하기위한 기술은 증명됩니다.

트렌스 제닉 모기를 구하는 A. aegypti의 태아의 Microinjection

이 영상에서 Nijole Jasinskiene는 뎅기열의 매개체인 이집트숲모기(Aedes aegypti)의 형질전환 모기를 생성하는 데 사용되는 방법론을 시연합니다...

안녕하세요, 저는 Anton James 교수님 연구실의 ya입니다. 오늘은 형질전환 모기 제작을 위해 ADIs Egypt 배아에 미세주입을 수행하는 방법을 보여드리겠습니다.미세 주입을 위한 배아를 얻으려면 암컷에게 혈액을 먹여야 합니다. 암컷은 목요일에 급여해야 합니다. 월요일부터 금요일까지 미세 주입을 진행하려는 경우에도 이 방법이 유효합니다.면솜을 넣은 후 물을 붓습니다. 면솜이 젖어 있어야 하며, 3 mm 직경의 흰색 원형 필터를 위에 올리고 아래로 누릅니다. 그다음 물을 붓고, 상단을 냅킨으로 닦아낸 뒤 면솜으로 닫아줍니다.준비가 완료되었습니다. 이제 10일령 암컷 6마리를 채집하여 잠시 동안 꺼내놓은 뒤, 27°C로 설정된 챔버 내의 암조건에 1시간 15분 동안 둡니다. 유리 니들을 사용하여 미세 주입용 니들을 제작하며, Polar Shuttle Instrument Corporation사의 P 87 모델을 사용합니다. 유리 니들을 링에 배치하고 양쪽에서 고정합니다.뚜껑을 닫고 바늘이 빨간색이 될 때까지 당깁니다. 이제 바늘을 연결하는 방법을 보여드리겠습니다. 당긴 후의 바늘들은 닫혀 있으므로 다시 열어주어야 합니다.두 가지 방법이 있습니다. 한 가지 방법은 연결하는 것이고, 다른 방법은 주입 전 배아를 단순히 터치하는 것입니다. 이제, 연결하는 방법을 설명하겠습니다.바늘을 준비하여 이곳에 고정합니다. 팁 윗부분은 미세 주입에 사용할 수 없습니다. 미세 주입을 위해서는 팁 끝이 열려 있어야 합니다.이것은 휠입니다. 바늘로 휠의 표면에 닿게 하며, 바늘 끝이 휠 표면에 접촉해야 합니다. 끝부분이 표면에 닿으면 휠을 장착해야 합니다.여기에서 바늘이 미세주입 준비가 된 것을 확인할 수 있습니다. 바늘 끝이 열려 있어 끝부분이 빛나는 것을 볼 수 있습니다. 이는 바늘이 개방되어 미세주입이 가능한 상태임을 의미합니다.주의할 점은 튜브의 끝부분만 부러뜨려야 한다는 것입니다. 구멍을 크게 만들면 바늘의 성능이 떨어집니다. 구멍은 매우 작게 만들어야 합니다.1시간 15분이 지났으며, 이제 배아를 마이크로 인젝션할 준비가 되었을 것입니다. 챔버에서 배아를 꺼내겠습니다. 시간이 조금 걸리겠지만, 종이 위에 검은 점처럼 보이는 배아들을 확인할 수 있습니다. 그리고 지금 암컷들을 케이지로 옮기고 있습니다. 암컷들이 스스로 날아가게 둡니다.이제 배아 정렬에 사용할 도구들을 보여드리겠습니다. 이 핀셋은 야생형 배아를 옮길 때 사

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

역방향 유전자 접근 방법은 모기에 벡터 병원균하는 유전자 underly 저항을 결정하는 매우 유용하게 입증했습니다. 이 비디오 프로토콜은 뎅그열 바이러스를 항구 여성 A. aegypti 모기로 dsRNA를 주입하기 위해 제임스 연구실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. , 주사 바늘을 보정 사출 설정을 조작하고, 흉부에 dsRNA를 주입에 대한 기술은 그림이다.

여성 A. aegypti 모기에의 dsRNA의 분사

아노 펠 레스 stephensi 모기가 말라리아 거주 인도 및 아시아 벡터입니다. 이 동영상은 모기에 말라리아에 대한 저항력을 부여합니다 transgenes이 종 microinjections을 수행하는 기법을 보여줍니다. 대부분이 동영상에서 보여주는 방법의 다른 모기 종의 microinjection 기술에 적용됩니다.

의 사출. stephensi의 태아는 말라리아 방지 모기를 생성하는

이 비디오에서는 마이크로주입을 통해 Anopheles 배아에서 phiC31 매개 부위 특이적 전이유전자 통합을 시연합니다. 이 방법은 연구 및 산업 응용을 위해 원하는 유전자를 숙주 시스템에 도입하는 데 도움이 됩니다.

phiC31-Integrase-Mediated Site-Directed Transgene Integration: Anopheles 벡터에 부위 특이적 전이유전자 통합을 위한 미세주입 기술

이 비디오에서는 배아 미세주입 기술을 통해 Anopheles gambiae 모기의 배아에 유전자 드라이브 구조를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 절차를 통해 상동 재조합을 통해 전달된 DNA 구조를 생식세포 세포에 통합하여 형질전환된 모기 개체군을 생성할 수 있습니다.

모기 배아 미세주입: 생식세포 돌연변이를 생성하기 위해 Anopheles gambiae의 배아 난황에 외인성 DNA를 전달하는 기술

지중해초파리(medfly) Ceratitis capitata(Diptera: Tephritidae)는 전 세계 농업 해충입니다. 이 식물의 생물학에 대한 깊은 이해는 메드플라이 개체군을 통제하여 경제적 영향을 줄이는 데 중요합니다. 배아 미세주입(embryo microinjection)은 이 종에서 생식세포 형질전환(germ-line transformation)과 역유전학(reverse genetics) 연구를 모두 가능하게 하는 근본적인 도구입니다.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

우리는 비 결함 재조합 Aedes aegypti densovirus (AaeDV) vivo에서 전달 시스템을 개발 하는 인공 intronic 작은 RNA 식 전략을 사용 하 여 보고 합니다. 건설, 포장, 및 애벌레 감염에 관해서는 뿐만 아니라 rAaeDV 벡터의 정량 분석에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다.

모기 유 충에서 유전자의 기능 분석에 대 한 유전자 납품 벡터로 재조합 모기 Densovirus의 사용

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

이 프로토콜은 φC31 시스템을 사용하여 Anopheles 말라리아 모기의 게놈에서 사이트 지향적 인 수정을 달성하는 방법을 설명합니다. 설명된 수정은 attP 베어링 도킹 라인의 게놈에 있는 형질전환 카세트의 통합 그리고 교환둘 다 포함됩니다.

말라리아의 아노필스 벡터에서 사이트 지향 φC31 중재 통합 및 카세트 교환

미세 주입 기술은 모기의 게놈에 외인성 유전자를 소개하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 제임스 실험실에서 DNA 구조를 Anopheles 감비아아에 미세 주입하여 변형된 모기를 생성하는 방법을 설명합니다.

아노펠레 감비아에 배아를 위한 미세 주입 방법

여기에서는 CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 모기 A. aegypti 에서 배아 미세주입을 통한 게놈 편집을 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR-Cas9을 이용한 황열병 모기 이집트숲모기(Mosquito Aedes aegypti )의 게놈 편집

배우세요 Aedes aegypti 모기 배아에 대한 마이크로인젝션 기술을 통해 트랜스제닉 모기를 생성하는 방법을. 이 방법은 바이러스 매개체 제어와 유전학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

트렌스 제닉 모기를 구하는 A. aegypti의 태아의 Microinjection

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