Name: 성인 Hippocampal 북극 그라운드 다람쥐 신경 줄기 세포의 성장과 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 학습하세요 북극 그라운드 다람쥐 성인 해마 신경 줄기 세포의 배양 및 분화 방법을. 이 기법은 뉴런과 신경교세포 비율 분석을 통해 신경발생 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 미국 육군 의료 연구 및 Materiel 명령 부여 # 05178001로하고 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소에서 NS041069 - 06에 의해 지원되었다. 우리는 프로토콜에 도움이 덧글에 대한 조엘 Vonnahme 감사합니다.

1. AGS 신경의 줄기 세포와 미디어 준비 <ol><li> 방식으로 분리된 신경 줄기 세포가 이전 9 설명한 성인 hippocampal 북극 그라운드 다람쥐 (AGS)는 지금 cryopreserved 튜브로 상업적으로 구할 수 있습니다. 세포는 세포가 cryopreserved 상태로 유지되도록 드라이 아이스가 들어있는 절연 패키지로 야간 배송됩니다. 무결성을 유지하기 위해 풀어 -150보다 낮은 즉시 수신 및 저장시 세포 ° C, 또는 액체 질소 듀어의 기상 단계 인치 </li><li> agsNSC 기초 매체를 준비 + 5% FBS를 95 ML agsNSC 기초 중간 5 ML FBS을 (LS - 1012)을 추가하여 </li><li> 500 μL B - 27 보충 (Invitrogen) 50 ML agsNSC 기초 중간에 추가하여 agsNSC 확장 매체를 준비합니다. 사용까지 1mL aliquots 및 -20 ° C에서 저장으로 B27의 나머지 부분을 나눕니다. </li><li> agsNSC 기초 매체의 따뜻한 25 ML + 5% FBS 및 37 ° C 물 목욕에 agsNSC 확장 중 20 ML. </li><li> 폴리 - L - ornithine과 확장에 사용되는 문장의 flasks <ol><li> 폴리 - L - ornithine (10 μg / ML) 작업 솔루션을 녹여. ° C 한번 해동 1 개월 최대 2-8 사이의 솔루션을 저장합니다. </li><li> 한 통풍 T - 75 플라스크 8 ML 폴리 - L - Ornithine 작업 솔루션을 추가하고 균일하게 술병의 전체 문화 표면을 통해 솔루션을 배포합니다. (사용 0.5 사용할 수있는 다른 문화 선박에 대한 작업 솔루션의 크기를 조정 -.. 10cm 두 문화의 표면 당 1.0 ML 폴리 - L - Ornithine 작업 솔루션) </li><li> 24 시간 최소 37 ° C에서 flasks을 품어. (추가 CO 2없이 보육의 사용은 폴리 - L - Ornithine 코팅 문화 선박의 보육에 대한 선호합니다.) 코팅 flasks는 인큐베이터 두 주에 저장할 수 있습니다. </li><li> 전에 사용하려면, 술병에서 폴리 - L - Ornithine 작업 솔루션을 기음과 무균 조직 배양 등급 물로 두 번 씻어. 플라스크를 사용하기 전에 거의 건조 때까지 액체를 대기음. </li></ol></li><li> 듀어에서 병을 제거하고 유리 뚜껑이 안전하게 밀폐되어 있는지 확인합니다. 병에 거의 완전히 해동 때까지 약 60~90초 또는 37 ° C 물 목욕에있는 유리병의 아래쪽 절반을 떠나는 유리병의 위쪽을 잡고, 얼음의 작은 금액이 계속 표시됩니다. 잠재적인 오염을 방지하기 위해, 물의 유리 뚜껑을 유지. , 해동 이상하지 않는 이렇게하면 세포가 손상될 수 있습니다. </li><li> 70 % 에탄올 또는 이소프로판올로 유리병의 외관을 스프레이, 다음 생물 학적 안전 캐비닛에 병을 놓습니다. 오염이나 튀기지 않도록 조심스럽게 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 부드럽게 멸균 피펫을 사용하여 agsNSC 기저 미디어 1 ML + 5% FBS을 추가하여 유리병에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. 따뜻한 agsNSC 기초 중의 25 ML에 다시 정지 세포를 전송 + 5% FBS를 50 ML의 원심 분리기 튜브 인치 </li><li> 희석 세포 현탁액과 함께 한 번 cryo - 병을 린스. 육분 150 XG에서 세포를 원심 분리기. 최상의 결과를 얻으려면 각각의 원심 분리기 유형에 대한 속도를 계산합니다. </li><li> 세포가 다운 스피닝 있지만, 건조 폴리 - L - ornithine 코팅 T - 75 플라스크에 agsNSC 확장 중 10 ML를 추가하고 RH FGF - 기본 (40ng/mL) 40 μL를 추가합니다. 원심 분리 후, 펠렛을 대기음하지 않도록 돌봐 뜨는 액체를 대기음. agsNSC 확장 중 10 ML에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. T - 75 플라스크에있는 미디어로 agsNSC 확장 중간에 다시 정지 세포를 전송합니다. </li><li> 부드럽게 골고루 용기 내에 세포를 배포하는 문화 선박 사이드 - 투 - 쪽 바위. </li><li> 37 ° C 5 % CO 2 배양기에 넣어 씨앗 문화 들어왔습니다. 세포는 술병에 부착하고 시딩 두 시간 프로세스를 형성하기 시작한다. 세포 부유 남아 매체 내의 최대 고사리면 5% FBS에서 세포를 원심 분리기 신선한 매체와 플라스크와 같이 1.8-1.10을 실행합니다. </li></ol> 2. AgsNSC 확대 <ol><li> 이틀 (~ 48 시간) 세포를 해동 및 시딩 후, 전체 매체 교체는 20 agsNSC 확장 매체의 ML 플러스 RH FGF - 기본의 40 μL의 스파이크를 사용하여 수행되어야합니다. </li><li> RH 하루를 다음의 접종에서 FGF - 기본 40 μL와 스파이크 flasks. 세포들은 접종 후 3,4 일로 75-80%의 합류에 도달하면 trypsinize 준비가되어있을 것입니다. 더 이상 배양은 세포가 3 단계 중 trypsinization에 의해 부상을 수 뉴런과 뉴런으로 차별화 시작할 수 있기 때문에 접종 후 사일 이상에 대한 Culturing가 undifferentiated 줄기 세포는하지 않는 것이 좋습니다. RH FGF - 기본은 최대 일주일 4 ° C에서 저장하고 계속 활동을 유지할 수 있습니다. 더 많은 시간이 필요한지 RH FGF - 기본은 또한 -20 ° C에 하나의 추가적인 동결 / 해동을 통해 이동할 수 있습니다. </li></ol> 3. 셀 Trypsinization <ol><li> agsNSC는 3~4일 접종 후 passaged해야합니다. agsNSC 다시 확장 될 수 passaging 전에 24 시간 그리고 1 주일 사이에 폴리 - L - ornithine 코팅 플라스크를 준비합니다. </li><li> 를 기음문화 선박의 매체입니다. 0.05 % 2.5 ML 추가 Trypsin/0.02 % 면적의 각 75cm 2 혈관에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (CM - 0017). 모든 세포를 보장하기 위해 부드럽게 소용돌이는 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)로 코팅하고 있습니다. 세포는 일반적으로 세포의 합류에 따라, 60 초 내에 표면에서 이탈을 시작합니다. trypsinize 이상하지 마, 이렇게 같이하면 세포를 손상됩니다. 부드럽게 여러 방면에서 문화의 혈관을 감청하는 것은 부대를 권장합니다. </li><li> 세포 분리가되면 agsNSC 기초 중간 10 ML을 추가 + 5% FBS를 술병 수 있습니다. 부드럽게 트립신 솔루션을 모두 보장하기 위해 소용돌이가 무력화됩니다. 무균 실험실 기법을 사용 agsNSC 기초 중간 5% FBS 10 ML를 포함하는 멸균 원심 튜브에 세포를 피펫. + agsNSC 기초 중간의 추가 10 ML로 다시 술병을 씻는 5 % FBS를 반복하고 처음으로 세척과 결합. </li><li> 육분 150 XG에 원심 분리기 세포는 위에서 설명한. 원심 분리 후, 세포가 깨끗한 느슨한 펠렛을 형성한다. 부드럽게 최대 pipetting과 10 ML의 피펫과 아래 배하여 원심 튜브에서 무력화 트립신과 매체를 기음과 미리 예열 agsNSC 기초 매체의 10 ML에 다시 중지 세포 펠릿 (당 T - 75 플라스크) + 5% FBS. 아래 설명된 셀 개수를 수행합니다. </li></ol> 4. 전지 도금 표준 계산 <ol><li> 무균 기술을 사용하여, 소용돌이 세포 현탁액과 microcentrifuge 관에 전송 세포 현탁액 15 μL. 0.4 % Trypan 블루 15 μL를 추가합니다. 부드럽게 믹스와 같은 챔버 (카탈로그 # 1490 : Hausser 과학, 계산 밝은 라인으로 깨끗한 hemacytometer의 방으로 각 세포 현탁액 10 μL를 로드할 수 <a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm</a> ). </li><li> hemacytometer 4 quadrants의 최소 개수. Trypan 블루 양성하는 푸른 세포가 죽은 계산되지 않습니다. 정확한 셀 카운트 들어, 사분면마다 세포의 최적의 숫자는 25-75 전지해야합니다. </li><li> 세포를 계산 후, 4 quadrants의 평균을 계산합니다. 10000에 의해 및 희석 요인에 의해 세포 카운트 평균을 곱하고 (2면 추천 볼륨을 사용) ML 당 세포의 수를 결정합니다. 총 비율 생존 미만 92% 경우 원인이 다수있을 수 있습니다. 낮은 생존을위한 하나의 이유는 FBS와 중화를 트립신하기 전에, trypsinization 이상있을 수 있습니다. 또 다른 이유는 트립신에 혈청의 농도 (FBS)이 너무 낮은이고 세포 trypsinized로 계속있을 수 있습니다. 셋째, 세포가 줄기 세포가 trypsinization 동안 부상에 이르는, 세포 - 세포 접촉에 의한 차별화하는 원인도 합류되었을 수도 있습니다. 이 방법은 밀접하게 이어지는 경우 3 명 이상 doublings의 수율은 ~ 500,000의 초기 숫자에서&gt; 4,000,000 세포의 인구를 제공 기대 수 있습니다. </li></ol> 5. 다른 확장 플라스크에 접종 <ol><li> 한 그릇을 예방하는 데 필요한 세포의 총 수를 확인하려면 주사하는 선박의 면적 (cm 2)에 의해 (cm 2 당 6,600 세포 또는 T - 75 플라스크 당 500,000 세포) 원하는 시딩 밀도를 곱하면됩니다. 하나 이상의 혈관을 inoculating 것은 선박의 총 숫자로 선박 당 세포의 숫자를 곱하면. 각 함선을 예방하는 데 필요한 세포 현탁액의 볼륨을 (ML)를 확인하려면, 실행 가능한 세포 / 세포 현탁액의 ML의 수를 한 그릇을 예방하는 데 필요한 세포의 수를 나눕니다. 하나 이상의 혈관을 inoculating 것은 주사하는 선박의 총 수를 한 선박에 필요한 볼륨을 곱하여 필요한 세포 현탁액의 전체 볼륨을 계산하는 경우. </li><li> 느슨한 펠렛을 떠나, agsNSC 기초 매체 세포의 원하는 볼륨 + 5% FBS를 원심 분리기. 일반적으로 500000 전지는 5% FBS과 같이 이전에 설명한 agsNSC 기초 중간에 25 ML 총 부피로 이동됩니다. 액체를 대기음하고이 추가 원심 분리 단계는 접종 전에 FBS를 제거하는 데 필요한 agsNSC 확장 중 10 ML에 느슨한 펠렛을 다시 일시 중지합니다. T - 75 플라스크에 미리 예열 agsNSC 확장 중 10 ML을 추가합니다. T - 75 플라스크에 resuspended 세포 현탁액의 10 ML을 추가하면 다음 RH 술병에 FGF - 기본 40 μL를 추가합니다. 한 번에 작업할 flasks의 최대 개수를 결정할 때 trypsinization 및 접종은 1.5 시간보다 더 오래 걸릴없는 것을 고려하십시오. 수많은 flasks를 사용하는 경우 하나는 전체 미디어의 변화에​​ 대한 충분한 미디어가 있어야합니다. </li><li> 부드럽게 골고루 세포를 배포 좌우로 술병을 바위와 같은 이전에 설명한 37 ° C 5 % CO 2 배양기로 배양 혈관을 넣으십시오. </li></ol> 6. 차별 화를위한 웰 플레이트에 접종에 대한 세포의 희석 <ol><li> 모든 멀티 - 음 형식으로 사용하지만, BD Biocoat 폴리 - L - 라이신 코팅 96 잘 접시에 접종이 데스는 수도여기 cribed. 96 멀티 잘 접시 잘 당 0.2 ML로 주사하는 우물의 수를 곱하여 실험에 필요한 세포 현탁액의 볼륨을 확인하고 접종하는 동안 볼륨의 손실을 충당하기 위해 약 10 %를 추가합니다. 75,000 세포 / ML의 세포 밀도로 희석을 계산합니다. 2퍼센트 FBS의 최종 농도 (표 1)을 달성하기 위해 차별화 매체에 추가로 FBS의 양을 결정합니다. FBS와 차별화 매체를 섞는다. 조심스럽게 FBS와 차별화 매체의 계산 볼륨있는 세포를 섞는다. (참고 : 원심 분리하는 동안 세포가 agsNSC 기초 중간에 + 5% FBS FBS는 원심 분리하는 동안 세포를 보호하고 세포 접착력 FBS가 differention을 억제 용이 동안 2 % FBS를 Diluting하면 다중 잘 표면에 세포의 접착력을 수 있습니다... 2% FBS는 다음 분화를 촉진하기 위해 추가로 희석합니다. 인슐린 트랜스페린 - 셀레늄은 (ITS - E)도 차별을 홍보하기 위해 차별화 매체에 포함되어 있습니다. </li><li> biosafety 캐비닛에서 멀티 채널 피펫 및 대형 구멍 도움말을 사용하여 폴리 - L - 라이신 코팅 96 - 웰 플레이트의 각 잘하는 살균 combitip 저수지에서 희석 세포 현탁액 200 UL 하는걸. 37 1.5-2 시간 동안 접시를 품어 ° C 5 % CO 2. 세포는 첨부에 대한 90-120분 후 신중하게 각 잘 사용하는 대형 오리피스 피펫 팁의 매체 (96 - 웰 플레이트 100 μL)를 50 %를 제거한 후. 조심스럽게 다시 큰 오리피스 피펫 팁을 사용하여 따뜻한 agsNSC 차별화 매체로 제거 볼륨을 교체하십시오. (표준 오리피스 팁 사용은 세포를 다치게 수 있습니다.) </li><li> 이틀 접종 후 (~ 48 시간), agsNSC 차별 매체 및 대형 오리피스 피펫 팁을 사용하여 50 % 중간 변경을 수행합니다. </li></ol> 7. 뉴런의 유지 보수 <ol><li> 지침에 따라 NeuraLife, 글루타민과 B27를 사용하여 유지 보수의 연결 매체를 준비합니다. 의 연결을 유지 매체는 매주 준비되어야합니다. </li><li> 마지막 agsNSC 차별화 매체 변경, 일반적으로 주 4 게시물 접종 후 이틀의 연결을 유지 매체를 사용하여 50 % 중간 대체를 수행합니다. </li><li> 모든 2~3일의 연결을 유지 매체를 사용하여 50 %의 중간 교체를 수행하는 계속합니다. 의 연결 프로세스의 연결을 유지 매체로 변화 몇 일 이내에 나타납니다. 세포의 연결을 유지 매체로 전송되는 3 주 이내에 사용해야합니다. 뉴런은 상용의 연결 마커 번호를 사용하여 확인할 수 있습니다. Astrocytes도 항상 관찰됩니다. </li><li> 문화 집단은 일반적으로 전체 휴대폰 번호로 뉴런의 이상 40 % 비율을 표현한다. NeuraLife 이외의 다른 신경 세포 유지 보수 미디어의 사용은 morphologically 성숙 보이지 않으며 한 문화에서 생존하지 않을 수 있습니다 하부 세포를 제공할 수 있습니다. </li></ol> 8. 대표 결과 : 북극 그라운드 다람쥐 성인 신경 줄기 세포가 500,000-600,000 cells/75mm 플라스크에 씨앗을 때 적어도 두 구절에 대한 3-5일의 모든 24 시간을 두 번 나갈 것입니다. 이러한 세포는 쉽게 basicFGF와 B27의 제거 및 1-2% FBS의 존재와 1 %의 인슐린 / 트랜스페린 / 셀레늄과 구분되며, 14-21일 이내 TUJ1 (Covance) 긍정적인 뉴런 (그림 2 참조)가 될 것입니다. 총 세포 뉴런의 비율은 문화의 연령에 따라 40~60%, (그림 3) 사이의 범위를합니다. 뉴런은 최소한 21일 포스트 시딩 통해 12일 포스트 시딩에서 실험을 위해 활용 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. AGS 성인 hippocampal 신경 줄기 세포의 현미경 사진. 폴리 - L - Ornithine 코팅 flasks에 agsNSC 기저 미디어 성장의 3 일 다음 AGS 성인 hippocampal 신경 줄기 세포의 위상 현미경 사진. 배로 약 24 시간마다 발생합니다. 100X 확대 사진. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 차별 AGS 성인 hippocampal 신경 줄기 세포의 형광 현미경 AGS 신경의 줄기 세포는 그 전에 해결 17 일간 Neuralife 유지 사일에 대한 차별화 미디어를 받게되었습니다. 전지는 4 % paraformaldehyde와 Invitrogen에서 TUJ1 기본 항체 (Covance)와 알렉사 플루어 568 차 항체 (녹색)를 사용하여 식별 뉴런과 해결되었습니다. Hoechst 염색 33,343은 모든 핵 (파란색)를 얼룩이 추가되었습니다. 휴대폰 번호, 뉴런 번호 및 신경 세포 비율은 neurite 가지 소프트웨어 및 Cellomics에서 Arrayscan 악기를 사용하여 결정됩니다. 이 사진은 약 57%의 뉴런을 나타냅니다. 10X 확대 <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 신경 세포의 숫자 세에서 차별 AGS 신경 줄기 세포의 신경 세포 비율문화 시대 AGS 신경의 줄기 세포 전에 해결 12, 15 및 17 일간 Neuralife 유지 후, 4 일간 차별화 미디어를 받게되었습니다. 세포 고정과 뉴런은 TUJ1 기본 항체 (Covance)로 식별되었습니다. Hoechst 염색은 총 세포 식별에 대한 모든 핵을 얼룩에 추가되었습니다. 휴대폰 번호, 신경 세포의 숫자와 %의 신경 세포 비율은 neurite 가지 소프트웨어 및 Cellomics에서 Arrayscan 악기를 사용하여 결정됩니다. 값 조건 당 15 웰스 + SD의 의미를 나타냅니다. passaging 및 시딩에서 사용되는 표 1. 샘플 계산 <ol><li> 700000 셀 / ML 세포 현탁액을 사용하여 </li><li> 75,000 셀 / ML 또는 15000 세포의 세포 밀도마다 잘 각 잘 0.2 ML 볼륨을 사용합니다. </li><li> 잘 = 19.2 ML 또는 원하는 최종 볼륨을 21 ML 당 0.2 ML에서 96 우물을 Inoculating. </li><li> (최종 농도 X 최종 볼륨) ÷ 초기 농도 = 초기 볼륨 (21 ML X 75,000 전지 / ML) ÷ 70 = 2.25 ML </li><li> 세포 현탁액의 FBS의 볼륨. 2.25 ML = 2.25 ML X 0.05 = 0.1125 ML </li><li> FBS의 볼륨은 21 ML = 21 ML X 0.02 = 0.42 ML이 필요 </li><li> 차별화 매체에 추가할 FBS의 볼륨 = 0.42 ML - 0.1125 = 0.3075 ML ML </li><li> 2.25 ML 세포 현탁액 - - 0.3075 ML 5% FBS가 = 18.44 ML 차별화 매체 = 21 ML의 볼륨. </li><li> 0.308 ML FBS와 18.44 ML 차별 매체를 결합하고 세포 현탁액의 2.25 ML를 추가합니다. </li></ol>

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</ol>

JA 켈러허 - 앤더슨은 Neuronascent의 설립자이며 북극 그라운드 다람쥐 특허 출원의 발명가입니다. Neuronascent는 AGS 미디어와 줄기 세포의 판매에 대한 로열티를받습니다. RC 맥기는 미디어와 AGS 신경 줄기 세포를 배포 라이프 라인 주식 회사에 의해 고용됩니다.

AGS 성인 신경 줄기 세포가 견고하고 그 기본적인 신경 줄기 세포 특성의 연구에 대한 신경 줄기 세포의 훌륭한 소스가 만드는 수많은 구절에 대한 확장하실 수 있습니다. 확장 속도가 약 두 배로 모든 이십사시간이지만, 세포 사이의 접촉 astrocytes에 차별을 선호하기 때문에 이러한 세포는 사전에 도달 합류하는 passaged해야합니다. 연락처 - 중재 차별 따라서 차별이 trypsinization하고 통과하기 전에 시작하면 전체 휴대폰 번호로 뉴런의 비율이 극적으로 드롭하게됩니다. 그림 1은 24 시간 이내 passaged해야 AGS 신경의 줄기 세포 배양을 보여줍니다. AGS 신경의 줄기 세포는 폴리 - L - 라이신 코팅 Biocoat 판에 강력하게 준수하고 FBS는 세포의 리프팅없이 90분 이내에 1 % 줄일 수 있습니다. FBS 및 rhFGFbasic이 제거됩니다로서 세포의 절반 뉴런과 반 astrocytes 약 차별화됩니다. 뉴런은 두 주 (그림 2) 내에서 T...

<table><tbody><tr><td>agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0004</td><td></td></tr><tr><td>agsNSC 확장 키트</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0008</td><td>DMEM/F12, B27 및 rhFGFb의 대체 공급원 (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>agsNSC 분화 키트</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0009</td><td>DMEM/F12 및 ITS-x의 대체 공급원 (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>NeuraLife 유지 배지 키트</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0012</td><td>대체 공급원은 NeuraBasal (LifeLine) 또는 Neurobasal (Invitrogen), glutamine 및 B27 (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)입니다. 분화된 세포는 NeuroLife에서 최대 3주까지 유지되지만, Neurobasal (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)에서는 2주를 초과하여 유지하지 않습니다.</td></tr><tr><td>마이크로미터 (Bright Line Counting Chamber 등)</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Biocoat Poly-L-Lysine 코팅 96웰 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>356516</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>대구경 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-141</td><td>피펫팅 시 신경 세포 손상을 방지합니다. &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

성인 hippocampal 북극 그라운드 다람쥐 신경 줄기 세포의 성장과 분화

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

북극 그라운드 다람쥐 (Urocitellus parryii, AGS)는 냉동 니어 1 또는 아래 핵심 체온과 최대 절전 모드로 자신의 능력 독특합니다. 이 동물은 또한 생체내 2,3와 산소 - 포도당 체외 4,5에서 빈곤의 뇌에 허혈성 손상에 저항. 이러한 독특한 자질 부상 국소 빈혈로 인한 세포 죽음과 아주 차가운 온도에 저항하는 AGS의 뉴런의 용량을 차지 수있는 고유의 연결 특성을 검사 AGS의 뉴런을 분리하는 자극을 제공했습니다. 확인 단백질 또는 이들 세포의 독특한 속성에 대한 허용 유전자 목표는 허혈성 징후의 번호와 추위 관용의 학습을위한 효과적인 치료법의 발견에 도움 수 있습니다. 성인 AGS의 해마 문화에서 이러한 줄기 세포 쉽게 확장 있도록 분아 따위에 의해 번식이 계속 신경 줄기 세포가 포함되어 있습니다. 우리는 여기서 연구자는 목적의 번호에 대한 이러한 줄기 세포와 차별화된 뉴런을 활용할 수있는 방법을 설명합니다. 밀접하게 다음 단계를 수행하여 AGS 신경 줄기 세포는 두 구절 이상을 통해 확장 가능하고 나누어 세포의 수를 최소화하기 위해 독성 화학 물질을 이용하지 않고 TUJ1 - 긍정적인 뉴런 (~ 50 %)의 높은 문화를 차별. 국소 빈혈은 neurogenesis 6 MEK / ERK 및 PI3K/Akt의 생존 신호 전달 경로 생체내 7과 체외 8 (켈러허 - 앤더슨, 드류 외., 준비)에 국소 빈혈 방지에 기여를 통해 수익금 neurogenesis를 유도. 이러한 고유 신경 세포의 자세한 특성은 이러한 방법의 일부 또는 전부를 사용하여 여러 전선에서 사전하실 수 있습니다.

신경 줄기 세포는 성인이 아닌 최대 절전 모드 예알링 북극 그라운드 다람쥐 (AGS)의 해마에서 준비되었다. 이러한 신경 줄기 세포는 여러 통로를 통해 확장 차별과 glial 문화에 거의 신경 50:50로 유지하실 수 있습니다.

성인 Hippocampal 북극 그라운드 다람쥐 신경 줄기 세포의 성장과 분화

북극땅다람쥐(Urocitellus parryii, AGS)는 중심 체온이 빙점 근처 또는 그 이하로 떨어진 상태에서 동면할 수 있는 독특한 능력을 갖추고 있습니다 1. 이들은...

이 프로시저의 전반적인 목적은 동면하지 않는 성체 1년생 북극 땅다람쥐의 해마에서 준비된 신경 줄기세포를 파종, 증식 및 분화시키는 것입니다. 이는 먼저 AGS 신경 줄기세포를 파종함으로써 수행됩니다. 그다음, 신경 줄기세포를 증식시켜 분화 배지에 파종합니다.절차의 세 번째 단계는 뉴런을 분화시키고 유지하는 것이며, 마지막으로 분석을 위해 세포를 고정하거나 처리 후 고정합니다. 궁극적으로, GS 신경 전구세포가 2주간의 분화 및 유지 기간 동안, 그리고 허혈 조건 하에서도 계속해서 분열한다는 결과를 얻을 수 있습니다. 뉴런의 수는 뉴런 비율을 측정하는 염색 및 형광 현미경 기법을 통해 결정합니다.이 기술의 함의는 뇌졸중 및 심정지 치료법 발견으로 확장됩니다. 북극다람쥐의 분화된 뉴런은 모든 허혈성 손상에 내성을 가집니다. 이 절차를 시작하기 전, 폴리올 오르니틴으로 코팅하여 A-G-S-N-S-C 증식에 사용할 플라스크를 준비하십시오. 폴리올 오르니틴 작업 용액을 인큐베이터에 넣어 두어 준비하십시오.해동 후, 용액은 2~8°C에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 통기성 T 75 플라스크에 Polyol ornithine 작동 용액 8 mL를 넣고, 용액이 플라스크의 전체 배양 표면에 고르게 퍼지도록 합니다. 사용 전, 플라스크를 37°C에서 최소 24시간 동안 배양하며, 가급적 CO2가 첨가되지 않은 배양기에서 진행하십시오.플라스크에서 Polyol ornithine 작동액을 흡입하여 제거하고, 멸균 조직 배양 등급수로 2회 세척하십시오. 액체를 흡입하여 플라스크를 거의 건조시킨 후, arctic ground squirrel 신경 줄기세포를 해동하고 분주하는 데 사용하십시오. 먼저, 액체 질소 보관함에서 A-G-S-N-S-C 바이알을 꺼내고 바이알 캡이 단단히 밀봉되었는지 확인하십시오.바이알의 하단 절반을 37 °C 항온수조에 약 60~90초 동안 담근 채 바이알의 윗부분을 잡습니다. 오염 가능성을 방지하기 위해 바이알 캡이 물에 닿지 않도록 하십시오. 바이알이 거의 완전히 해동되면 항온수조에서 꺼냅니다.소량의 얼음이 여전히 보여야 합니다. 과도하게 해동하면 세포가 손상될 수 있으므로 주의하십시오. 바이알 외부를 70% ethanol 또는 isopropanol로 분무한 다음, 바이알을 생물안전작업대(BSC)로 옮기십시오.오염이나 튀김을 방지하기 위해 캡을 조심스럽게 제거하십시오. 멸균 피펫을 사용하여 바이알에 기초 배지 1 mL를 첨가하고 부드럽게 재현탁하십시오.세포를 현탁합니다. 재현탁된 세포를 50 mL 원심분리 튜브에 담긴 25 milliliters의 따뜻한 기초 배지로 옮깁니다. 세포가 가라앉는 동안 150 G에서 6분 동안 세포를 원심분리합니다.건조된 poly L ornithine 코팅 T 75 플라스크에 확장 배지 10 milliliters를 넣고, Rh FGF basic 40 microliters를 추가합니다. 원심분리가 완료되면, 펠렛이 흡입되지 않도록 상층액과 액체를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 세포를 확장 배지 10 milliliters에 현탁합니다.재현탁된 세포를 T 75 플라스크의 배지로 옮깁니다. 플라스크를 부드럽게 좌우로 흔들어 용기 내에 세포가 고르게 분산되도록 합니다. 세포가 접종된 플라스크를 37 °C, 5% carbon dioxide 인큐베이터에 넣습니다.세포는 접종 다음 날 파종 후 2시간 이내에 플라스크에 부착되어 돌기를 형성하기 시작해야 합니다. A-G-S-N-S-C가 담긴 플라스크에 40 µL의 Rh FGF basic을 첨가하십시오. 세포 해동 및 파종 2일 후, 접종 후 3일 또는 4일째에 20 mL의 증식 배지에 40 µL의 Rh FGF basic을 첨가하여 배지를 완전히 교체하십시오.A-G-S-N-S-C의 계대 배양을 위해 T 75 플라스크의 배지를 흡입하여 제거하고 2.5 milliliters의 trypsin EDTA를 첨가합니다. 모든 세포가 trypsin EDTA로 덮이도록 부드럽게 회전시키고, 세포의 탈착을 유도하기 위해 배양 용기의 여러 측면을 가볍게 두드립니다. 세포가 탈착되면 플라스크에 10 milliliters의 basal medium을 첨가하고, 모든 trypsin 용액이 중화되도록 부드럽게 회전시킵니다.세포를 10 milliliters의 기초 배지가 들어 있는 멸균 원심분리 튜브에 피펫으로 옮깁니다. 그런 다음 플라스크를 추가로 10 milliliters의 기초 배지로 세척하여 첫 번째 세척액과 합친 후, 세포를 150 G에서 6분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 세포가 깨끗하고 느슨한 펠릿을 형성하면, 원심분리 튜브에서 상층액을 흡입하여 제거합니다.그런 다음 10 mL 피펫을 사용하여 미리 데워둔 기초 배지 10 mL를 넣고 재현탁합니다. 피펫팅을 통해 부드럽게 두 번 위아래로 섞어 세포 펠렛을 현탁시킵니다. 이 방법을 엄격히 따르면 3회 이상의 배가 시간을 기대할 수 있으며, 초기 약 500,000개의 세포로부터 400만 개 이상의 세포 집단을 얻을 수 있습니다. 본 영상에서는 분화를 위해 poly L lysine이 코팅된 96 Well 플레이트에 A-G-S-N-S-C를 접종하는 과정을 시연하지만, 이 절차에는 모든 다중 웰 형식을 사용할 수 있습니다.먼저, 실험에 필요한 세포 현탁액의 부피와 A-G-S-N-S-C 분화 배지의 최종 농도가 2%FBS가 되도록 첨가해야 할 FBS의 양을 결정하십시오. 이러한 계산 예시는 다음의 생물안전작업대 내 프로토콜 텍스트에 나와 있습니다. FBS와 분화 배지를 혼합하십시오.그 다음, 세포를 FBS가 포함된 분화 배지의 계산된 부피와 조심스럽게 혼합하고, 배지에 섞인 세포를 멸균된 콤비 팁 리저버로 옮깁니다. 멀티채널 피펫과 구경이 큰 팁을 사용하여, 리저버로부터 희석된 세포 현탁액 200 µL를 poly L lysine이 코팅된 96-well 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 세포가 부착될 수 있도록 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 1.5~2시간 동안 배양합니다. 배지.일반 크기의 피펫 팁을 사용하면 실제로 세포에 손상을 줄 수 있으므로, 배지 교체 과정이 이 기술에서 까다로운 부분이 될 수 있습니다. 따라서 배지 교체 중 세포가 손상되지 않도록 와이드 보어(large orifice) 피펫 팁을 사용합니다. 세포가 부착되면 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 각 웰에서 배지의 50%(이 경우 100 µL)를 조심스럽게 제거하십시오.제거한 부피만큼 따뜻한 분화 배지로 조심스럽게 채웁니다. 이때 다시 한번 넓은 입구의 피펫 팁을 사용하십시오. 접종 2일 후, 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양합니다.분화 배지와 대구경 피펫 팁을 사용하여 배지의 50%를 교체합니다. 신경세포 유지용 배지는 제조사의 지침에 따라 매주 준비해야 합니다. 마지막 분화 단계 이후 2일이 지난 시점에 수행합니다.배지 교체. 뉴런 유지 배지를 사용하여 배지의 50%를 교체합니다. 대구경 피펫 팁을 사용하여 각 웰에서 분화 배지 100 microliters를 조심스럽게 제거하고, 뉴런 유지 배지 100 microliters로 교체합니다.2~3일마다 신경세포 유지 배지를 사용하여 50% 배지 교체를 계속 수행하십시오. 신경세포 유지 배지로 교체한 후 며칠 이내에 신경 돌기가 나타나야 합니다. 세포는 신경세포 유지 배지로 옮긴 후 3주 이내에 사용해야 합니다.중형 북극지다람쥐. 성체 신경줄기세포를 75 square centimeter 플라스크당 500, 000 내지 600, 000 cells 밀도로 배양하면, 최소 2계대까지 3~5일 동안 24시간마다 계속해서 배가됩니다. 이 100배 광학 현미경 사진은 A-G-S-N-S-C에서 3일 동안 배양한 GS 성체 해마 신경줄기세포를 보여줍니다.FBS와 RH FGF basic을 제거한 후, 폴리올 오르니틴이 코팅된 플라스크 내의 기초 배지를 교체합니다. A GS 신경 줄기세포는 약 절반은 뉴런으로, 나머지 절반은 성상교세포로 분화하게 됩니다. 이 형광 현미경 사진에서 보는 바와 같이, 뉴런은 14~21일 이내에 T tuj one 양성 반응을 보입니다.여기서 세포는 4% paraform, aldehyde로 고정되었으며, 뉴런은 녹색으로 식별되었습니다. TJ one 1차 항체와 LOR 5 68 2차 항체를 사용하였으며, 모든 핵은 hooks die를 첨가하여 청색으로 염색되었습니다. 뉴런과 전체 세포의 비율은 배양 기간에 따라 40에서 60% 사이로 나타납니다.이 그래프는 접종 후 16일, 19일, 21일 차에 분화된 GS 신경 줄기세포의 뉴런 수와 뉴런 비율을 보여줍니다. 분화의 경우, 세포 배양 후 12일부터 최소 21일까지 뉴런을 실험에 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 허혈 실험에 사용할 북극땅다람쥐 뉴런을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 신경구 형성 과정과 해마 조직으로부터의 확장 과정을 보여줍니다. 출생 후 생쥐의 신경줄기세포와 전구세포는 이랑 조직을 치열하게 하여 증식하여 1차 신경구를 형성한 다음 다시 파종하여 2차 신경구를 형성합니다.

Formation and Expansion of Neurospheres from a Hippocampal Tissue

성인의 뇌에서 수확 한 신경 줄기 세포는 신경 시스템 개발의 기초 연구에서 재생 의학의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 탐험에 이르기까지 다양한 애플리케이션에 활용 증가하고있다. 이 실험 결과를 소리를하는 것이 중요합니다 이러한 세포를 성장하는 데 사용되는 분리 및 배양 조건에서 엄격한 통제를한다.

성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

이 비디오 기사는 동일한 조직 절편 내에서 성체 해마 신경 발생의 모든 단계를 감지하고 정량화하는 포괄적인 프로토콜을 보여줍니다. 우리는 다른 숙주 종의 적절한 항체를 사용할 수 없을 때 발생하는 간접 다중 면역 형광의 한계를 극복하기 위한 방법을 정교하게 만들었습니다.

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

우리는 성체 쥐 뇌의 뇌실하부(SVZ)에서 신경줄기세포(NSC)와 그 자손을 분리하기 위한 FACS(Fluorescent Activated Cell Sorting) 기반 방법을 보고합니다. FUCCI(Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) 형질전환 마우스에 적용되어 라이브 이미징을 통한 세포 주기 진행을 연구할 수 있습니다.

셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

송곳니 뇌는 성인 신경 연구에 귀중한 모델입니다. 분리 및 기본 뇌 조직에서 성인 개 해마 신경 전구 세포 확장을위한 프로토콜은 여기에 표시됩니다.

분리 및 성인 개 해마 신경 전구체의 확장

이 프로토콜의 목표는 특정 국소 신경 회로의 화학 유전적 조작에 응하여 성인 신경 줄기/전구 세포의 행동을 분석하기 위한 접근법을 설명하는 것입니다.

성인 해마 신경 전구세포의 회로 특정 조절 을 시술

여기에 제시된 것은 고밀도 도금 뉴런으로부터 신경 전구 세포에서 농축된 신경구의 자발적인 생성을 위한 프로토콜이다. 동일한 실험 동안, 뉴런은 낮은 밀도에서 도금 될 때, 프로토콜은 또한 장기간된 기본 쥐 신경 배양 결과.

E14-E16 스프라그 Dawley 쥐 배아에서 분리된 혼합 된 기본 해마 및 피질 뉴런에서 신경 구의 생성

이 기사에서는, 구체적으로, 메인 마우스 신경생성 틈새에서 유래된 산후 마우스 신경 줄기 세포로부터의 신경구 배양물의 생성을 위한 프로토콜을 설명한다. 신경구는 전구체 세포 수의 추정을 허용하는 두뇌 조직에서 신경 줄기 세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 더욱이, 이 3D 구조물은 세포 운명의 연구 결과허용하는 신경, oligodendrocytes 및 성상 세포를 초래하는 분화한 조건에서 도금될 수 있습니다.

산후 (P1−3) 마우스 신경성 틈새에서 신경구의 격리 그리고 확장

신경 프로그래밍에 의해 생성 된 인간 다 능성 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런의 이식은 신경 발달 장애에 대한 잠재적 인 치료 접근법이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런 전구체의 생성 및 신생아 마우스의 뇌에 이식하여 이식 된 뉴런의 장기 조사 및 치료 잠재력 평가를 가능하게합니다.

신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마에 이식

여기에서는 성체 쥐 뇌실 영역에서 분리된 확장된 신경 줄기 세포(NSC)에서 유전자 전달 효율성을 향상시키도록 설계된 핵절충 시스템에 대해 설명합니다. 이 연구 결과는 이 방법이 NSC의 유전자 섭동을 크게 개선하여 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하고 세포 생존율을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

학습하세요 북극 그라운드 다람쥐 성인 해마 신경 줄기 세포의 배양 및 분화 방법을. 이 기법은 뉴런과 신경교세포 비율 분석을 통해 신경발생 메커니즘 연구에 활용됩니다.

성인 Hippocampal 북극 그라운드 다람쥐 신경 줄기 세포의 성장과 분화

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