포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell) 또는 RG cs는 시신경을 통해 망막에서 뇌로 시각 정보를 전달하는 중추신경계 뉴런입니다. 동반 비디오에서는 성인 중추 신경계에서 자가사멸 신경세포 사멸 모델로서 전체 망막 신경절 집단의 축삭돌기를 동성애화하거나 절단하는 방법이 시연되었습니다. 여기서 이 방법은 신경 영양 인자, 짧은 간섭 RNA, 플라스미드 또는 손상된 망막 신경절 세포 또는 망막에 항 ATO 단백질을 암호화하여 전 세계적으로 망막을 표적으로 삼는 바이러스 벡터를 직접 표적으로 하는 절차와 결합됩니다.

안구 주사 장치를 조립하여 눈의 유리체실에 물질을 주입하여 망막 신경절 세포를 특이적으로 표적으로 삼는 데 사용됩니다. 겔폼(Gelfoam)을 배치하거나 해밀턴(Hamilton) 주사기를 사용하여 시신경에 물질을 주입합니다. 그루터기 이미징 결과는 항세포사멸인자(anti-apoptotic factor)의 전달에 의해 망막 신경절 세포의 생존을 증가시킬 수 있음을 나타냅니다.

이러한 기술을 사용하여 이 방법은 중추 신경계에서 성인 뉴런 자멸사에 관여하는 단백질을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 시신경 절개는 성인 중추신경계의 신경 세포사멸에 대한 재현 가능한 모델이기 때문에 이 기술의 의미는 중추신경계 질환의 치료 또는 진단으로 확장됩니다.일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사람들은 유리 피펫을 눈의 유리체실에 삽입할 때 수정체가 손상되기 때문에 어려움을 겪습니다. 안구 주사를 위한 주사기 시스템을 준비하려면 먼저 바늘 또는 RN 너트를 제거합니다.

10 마이크로 리터 rn gast tight 1701 Hamilton 주사기에 존재합니다. PFA feral을 압축 피팅의 피크 컵 feral에 삽입합니다. 그런 다음 주사기 끝에 완전한 피팅을 삽입하고 상단에 RN 너트를 느슨하게 나사로 조입니다.

하나의 16인치 피크 튜빙의 한쪽 끝을 RN 너트의 구멍을 통해 압축 피팅에 삽입합니다. 피크 튜브가 완전히 장착되었는지 확인하십시오. RN 너트를 조여 피크 튜브를 밀봉하는 야생 동물을 압축합니다.

듀얼 RN 글래스 커플러의 양쪽 끝에서 이 과정을 반복합니다. RN 너트 지지대를 조여 피크 튜브의 자유 끝을 이중 RN 유리 커플러의 한쪽 끝에 부착합니다. 유리 마이크로 피펫은 주입 시스템의 바늘과 배럴을 형성합니다.

유리 피펫을 듀얼 RN 유리 커플러의 다른 쪽 끝에 삽입합니다. RN 너트를 조여 피펫을 제자리에 고정합니다. 해부 현미경 아래에서 당겨진 마이크로 피펫을 비스듬히 잡고 유리 슬라이드의 유리 프로스팅을 따라 팁을 문질러 브레이크를 만들어 적절한 직경의 팁을 만듭니다.

이상적으로는 최종 팁이 약간 경사져야 합니다. 다음으로, 주사기, 피크 튜빙 링커, 듀얼 RN 유리 커플러 및 미네랄 오일이 함유된 유리 마이크로 피펫으로 채워진 Hamilton Syringe Company의 프라이밍 키트를 사용합니다. 유압 분사 시스템을 사용하여 바늘을 Hamilton 9 0 0 3 0 바늘로 교체하십시오.

그런 다음 Hamilton 9 0 0 3 0 바늘 위에 고무 격막을 올려 미네랄 오일을 주입하는 동안 밀봉을 제공합니다. 프라이밍 주사기의 Hamilton 9 0 0 3 0 바늘을 주입 시스템의 10마이크로리터 Hamilton 주사기의 배럴 뒷면에 삽입합니다. 격막을 주사기 끝에 단단히 눌러 밀봉을 만듭니다.

플런저를 천천히 누르면 미네랄 오일이 주입 시스템의 유리 요소를 통과합니다. 유리 피펫을 채우는 중입니다. 관을 따라 기포를 제거하기 위해 주입 시스템을 통해 모든 오일을 밀어 넣습니다.

충전 주사기에 미네랄 오일이 떨어지면 지속적으로 오일을 분배하면서 바늘을 천천히 빼냅니다. 기포 형성을 방지하려면 프라이밍 주사기를 다시 채우고 다시 주입하십시오. 전체 시스템이 미네랄 오일로 채워지면 10 마이크로 리터의 원래 플런저를 삽입하십시오.

해밀턴 주사기는 플런저를 완전히 눌러 시스템에서 추가 미네랄 오일을 제거합니다. 유리 마이크로 피펫과 주사기 끝을 깨끗이 닦습니다. 70%에탄올을 사용하면 플런저를 배럴의 2마이크로리터 표시로 빼냅니다.

유리 마이크로 피펫의 끝은 공기로 채워져 미네랄 오일과 주입 할 유체 사이에 완충 지대를 제공합니다. 마이크로 피펫의 끝을 원하는 용액에 넣고 Hamilton 주사기의 플런저를 빼내어 피펫 배럴을 채웁니다. 4-5마이크로리터 이하의 용액을 성인 쥐의 눈에 주입하여 안구 주사를 수행합니다.

가스 흐름을 입체식 프레임용 방독면 부착물로 전환하여 시작합니다. 그런 다음 불소 마취 된 쥐를 정위 계에 놓습니다. 불소 농도를 2%로 낮추고 마취를 모니터링합니다.

동물을 수술용 담요로 덮으십시오. 수술 내내 체온을 유지하려면 눈꺼풀을 열고 아칸 마취액 한 방울을 떨어뜨립니다. 각막 주사 표면에는 유리 피펫을 유리체 챔버에 삽입하고 피펫 위치를 유지하기 위해 두 사람이 필요합니다.

그리고 다른 하나는 주사기의 플런저를 눌러 원하는 솔루션을 제공합니다. 수술 현미경으로 유리 마이크로 피펫과 듀얼 RN 유리 커플러를 잡고 눈꺼풀을 벌려 주사 부위 반대편에 V 자 모양을 형성합니다. 손가락으로 눈이 궤도 밖으로 올라갑니다. 유리 마이크로 피펫의 끝을 혈관이 없는 부위와 공막을 통해 아래쪽 각도로 부드럽게 삽입합니다.

피펫이 공막을 관통하면 작은 팝이 느껴집니다. 주사기를 들고 있는 사람은 이제 플런저를 주사기의 2마이크로리터 표시까지 눌러 4마이크로리터의 용액을 주입해야 합니다. 주입은 약 1-2초 정도 걸립니다.

성공적으로 주입된 용액은 유리체 챔버를 통해 플러시하고 마이크로 피펫을 약 5초 동안 안정적으로 유지한 다음 같은 방향으로 물러납니다.바늘이 삽입되면 결막이 작은 구멍 위로 펄럭여 공막 천자를 밀봉하는 데 도움이 됩니다. 수술이 완료되면 불소를 끄고 동물이 몇 분 동안 산소를 호흡하도록 합니다. 각막 표면을 안과 연고로 덮습니다.회복 중 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 정위 장치에서 동물을 제거하고 회수 케이지로 되돌립니다.

이삭 투개술 후 역행 수송을 통해 망막 신경절 세포를 조작합니다. 먼저 동반 비디오 시신경 절개 프로토콜, 2, 2, 4, 1 추적자 약물의 지침에 따라 시신경 절개를 수행합니다. 플라스미드, siRNA 또는 바이러스 벡터를 시신경 그루터기에 적용할 수 있습니다.

이 절차를 수행하는 두 가지 주요 방법은 젤 폼을 사용하거나 시신경에 직접 주입하는 것입니다. 겔 폼 방법을 사용하는 경우, 분류학 1주일 전에 상구에 역행 추적자를 주입하여 망막 신경절 세포가 사전 라벨링되었는지 확인하십시오. 시신경을 절단한 직후, 실험 용액에 적신 작은 젤 폼 조각을 transection된 시신경 그루터기 위에 놓고, 안와 내용물을 이전 위치로 되돌립니다.

눈이 중립 위치로 돌아오면 집게를 사용하여 젤 폼 조각을 안와로 밀어 시신경 끝 위에 남아 있는지 확인합니다. 주입 기술은 op 플라즈마 흐름에 의해 크게 소급하여 운반되기 위해 축삭의 세포질에 접근해야 하는 물질의 전달에 더 효과적이며, 가스가 꽉 찬 10마이크로리터 해밀턴 주사기를 사용하여 원하는 용액을 transection된 시신경에 주입합니다. 짧은 경사가 있는 바늘이 바람직합니다.

주사기에 주입할 용액 10마이크로리터를 로드합니다. 일반적으로 irna plasmids 또는 바이러스 벡터를 주입하기 위해 미세한 팁 dumont 겸자로 시신경의 가장자리를 잡습니다. 바늘 끝을 신경과 평행하게 시신경에 삽입합니다.

경사가 더 이상 보이지 않을 때까지 삽입된 바늘은 신경에 의해 모든 면이 둘러싸입니다. 바늘이 삽입되면 가는 끝 집게로 신경 측면을 부드럽게 짜고 주사기를 회전시키면서 용액의 1/4을 주입합니다. 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 1/4 바퀴 돌립니다.

바늘의 전체 회전이 완료되고 주사기의 전체 내용물이 주입될 때까지 이 단계를 계속 반복합니다. 신경에서 주사기 끝을 제거합니다. 안와 내의 신경에서 역류가 있는 주입된 액체는 축삭돌기 끝에서 흡수할 수 있는 추가 풀을 형성하므로 그대로 두십시오.

안와 내용물을 원래 위치로 되돌리고 상처를 봉합하고 동물이 회복할 수 있도록 합니다. 동물은 수술 후 독립적으로 수용해야 합니다. 수술 후 진통제는 동물 관리 지침에 따라 투여해야 합니다.

당국과 동물은 수술 후 주의 깊게 모니터링해야 합니다. 이 비디오에서 볼 수 있듯이 망막 신경절제는 펩타이드, 약물, 벡터, 플라스미드 또는 siRNA를 형질전환 시신경 그루터기에 전달하여 직접 표적화할 수 있습니다. 이 대표적인 예에서, 플루오로 골드 역행 표지를 수행하고 SI 3 표지 펩타이드를 즉시 시신경에 주입했습니다.

그런 다음 고정 중에 펩타이드가 조직에서 침출되는 것을 방지하기 위해 망막의 라이브 이미징을 수행했으며, 여기에서 볼 수 있듯이 시신경에 주입된 SI 3개의 표지된 펩타이드는 레트로되어 망막의 망막 신경절 세포체로 크게 다시 운반되었습니다. 이 예에서는 SI 3 표지된 siRNA를 시신경 그루터기에 주입했습니다. 망막의 분류절개술과 실시간 이미징이 다시 수행된 직후, 시신경에 주입된 SI 3개의 표지된 siRNA는 역행하여 공동 국소화에 의해 표시된 대로 RG CS에 의해 운반되었습니다.

fluorgold retrograde 라벨링 사용일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 몇 초 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 렌즈가 손상되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 바이러스 입자에 대한 작업은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 생물학적 위험 작업에 대한 제도적 지침을 따라야 한다는 것을 잊지 마십시오.