Name: 포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-12T14:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 학습하세요 포유류 중추신경계에서 시신경 절단 후 망막신경절세포를 표적하는 실험 방법을. 안내구 주사 장치와 Hamilton 주사기를 활용하여 항아포토시스 인자를 전달하고 신경세포 사멸 메커니즘을 연구합니다.

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1. 외과 기술 <ol><li> 실험 무균 기술을 사용하여 특정 기관의 동물 사용 프로토콜에 따라 수행하여야한다. 살아있는 조직과 접촉으로 오는 악기와 자료 (솔루션, 시험 물질, 추적기, 바늘 등) 동물 복지 및 연구에 대한 잠재적인 부정적 영향에 감염하고 불리한 영향을 방지하기 위해 멸균해야합니다. </li></ol> 2. 마취 <ol><li> 쥐 한 동물 isoflurane 기화기 시스템을 사용 anaesthetized 것입니다. 0.8 L / isoflurane 가스를 기화하는 분의 비율로 의료 학년 산소를 사용하십시오. 첨부된 마취 상자에 동물을 배치하고 호흡이 둔화하고 있으며 동물이 진정 될때까지 4퍼센트의 isoflurane 농도에 전화. </li><li> 다음, stereotaxic 프레임 가스 마스크 첨부 파일에 가스 흐름을 스위치와 stereotaxic 장치에 동물을 놓으십시오. 2 % isoflurane 농도를 켜고 마취를 모니터링합니다. 큰 동물 (&gt; 300g)는 isoflurane의 높은 농도를 필요로 할 수 있습니다. 마취는 수술 중에 모니터링하고 isoflurane 복용량이 적절하게 조정해야합니다. 깊이와 호흡 속도는 지속적으로 평가해야하고, 깊은 고통의 부재에 대한 발가락 핀치 평가 (매 5 분)을 수행하여야한다. </li><li> 수술이 완료되면, isoflurane을 해제하고 stereotaxic 장치에서 제거하기 전에 몇 분 동안 호흡 산소에 동물을 허용합니다. 체온은 수술 담요 및 / 동물을 포함하거나 수술하는 동안 규제 난방 담요를 사용하여 유지 관리해야합니다. </li></ol> 3. Intraocular 주입을위한 주사 준비 <ol><li> 첫째, intraocular 주사를 수행하는 주사기 시스템을 조립. 10 μL RN Gastight 1,701 해밀턴 주사기 주입에 사용됩니다. 주사기의 끝부분에있는 모든 바늘이나 RN 너트 선물을 제거합니다. </li><li> 압축 피팅 물미 피크 컵에 PFA 물미를 삽입합니다. 그런 다음 주사기의 끝부분에 완벽한 피팅을 삽입하고 느슨하게 맨 위로 RN 너트를 나사. </li><li> RN 너트의 구멍을 통해 압축 피팅에 16분의 1 인치 피크 튜브의 한쪽 끝을 넣습니다. 피크 튜브가 완전히 장착되어 있는지 확인하십시오. 피크 튜브를 밀봉, 물미을 압축 RN 너트를 조이십시오. </li><li> 듀얼 RN 유리 커플러의 양쪽에 3.2 단계 수행합니다. RN 너트를 강화하여 이중 RN 유리 커플러의 한쪽 끝을 위해 피크 튜브의 자유로운 끝을 연결합니다. </li><li> 가져온 유리 micropipette는 분사 시스템의 바늘과 총구를 형성합니다. 유리 pipettes를 조작 1.5 mm OD 두께 벽으로 둘러싸인 유리 모세관 튜브를 사용하여 듀얼 RN 유리 커플러의 자유로운 끝에 유리 피펫을 삽입합니다. 장소에 피펫을 수정하기 위해 RN 너트를 조이십시오. </li><li> 가져온 유리 micropipettes의 벌금 끝이 intraocular 주사를 수행하기위한 일반적으로 너무 작습니다. 적절한 직경의 팁을를 생성하기 위해, 수술 현미경을 사용하여 시각적인지도 아래 유리 피펫의 팁을 휴식. 유리 슬라이드 표본의 프로스트 엔드 잘 피펫을 깰 적합합니다. 각도에서 피펫 잡고 휴식을 만들기 위해 유리 설탕을 입힘 따라 팁을 문지 르세요. 이상적으로, 최종 팁 약간 bevelled해야합니다. 좋은 팁을 생산하기 위해 몇 가지 시도 걸릴 수 있으므로 사용하기 전에 여러 pipettes를 가져옵니다. </li><li> 분사 시스템은 유압합니다. 따라서, 주사기, 피크 튜브의 링커, 듀얼 RN 유리 커플러와 유리 micropipette는 사용하기 전에 미네랄 오일로 가득해야합니다. 해밀턴 주사기 (주) (PRMKIT)에서 마중물 키트를 사용하여, 미네랄 오일 마중물 주사기를 입력하십시오. 점성 오일 쉽게 통과를 허용하는 큰 직경의 바늘을 사용합니다. 10 μL 해밀턴 주사기의 총신 내부 맞는 해밀턴 90,030 바늘로 바늘을 교체합니다. 다음, 미네랄 오일을 주입하면서 인감을 제공하기 위해, 해밀턴 90,030 바늘을 통해 고무 심장을 넣으십시오. </li><li> 분사 시스템의 10 μL 해밀턴 주사기의 통의 후면에 마중물 주사기의 해밀턴 90,030 바늘을 삽입합니다. 도장을 만들 수있는 주사기의 끝을 단단히 대한 심장을 누르십시오. </li><li> 천천히 플런저를 우울. 당신은 분사 시스템의 유리 요소를 통해 미네랄 오일 패스를보고, 마지막으로 유리 피펫을 작성합니다. 넓이 함께하는 기포를 제거하기 위해 분사 시스템을 통해 오일을 모두 밀어. 충전 주사기는 광유에서 실행하고있는 경우 지속적으로 공기 방울 형성​​을 방지하기 위해 기름을 분배하면서 천천히 바늘을 철회. 리필 마중물 주사기를 다시 주입. </li><li> 전체 시스템을 무료로 미네랄 오일과 거품으로 가득되면 10 μL 해밀턴 주사기의 원래 플런저를 삽입합니다. 시스템에서 추가적인 미네랄 오일을 제거하기 위해서는 여행이 끝날 때까지 플런저를 우울하게. 유리 micropipette 깨끗하고 70 % 에탄올로 세척 주사기의 끝을 닦아주십시오. </li><li> Withdraw 배럴에서 2 μL 표시 주사기의 플런저. 유리 micropipette의 끝 공기가 미네랄 오일 주입으로 원하는 유체 사이의 버퍼 영역을 제공하는 작성합니다. 피펫 바렐 이제 원하는 솔루션에 micropipette의 끝에 배치하고 해밀턴 주사기의 플런저를 철수 통해서하실 수 있습니다. 성인 쥐 안구에 솔루션 이상의 4-5 μL를 주입하지 마십시오. </li></ol> 4. Intraocular 사출 절차 : 전세계 망막 타겟팅 <ol><li> anesthetized과 stereotaxic 프레임 (로 제 2의 설명에)에서 보안 동물, Alcaine 아이가 몸에 붙이기도 각막을 마취하는 방울 사용합니다. 손가락과 장소 각막의 표면에 마취 솔루션 중 하나를 드롭으로 눈꺼풀을 엽니다. </li><li> 하나는 유리체 챔버에 유리 피펫을 삽입하고 피펫 위치를 유지하고, 또 원하는 솔루션을 제공 주사기의 플런저를 우울하게하는하기 : 사출은 두 사람이 필요합니다. </li><li> 수술 현미경, 그립 유리 micropipette과 손가락으로 듀얼 RN 유리 커플러에서. 사출 사이트의 맞은편에 "V"모양을 형성, 무료 손의 손가락으로 눈꺼풀을 전파. 눈꺼풀에 견인을 적용하여, 눈은 limbus 뒤에 사후 표면을 노출, 궤도 밖으로 상승됩니다. 사출 사이트 반대편 손가락으로 'V'모양을 만들어, 크래들은 주입했을 때 눈이 안정성을 제공 형성됩니다. </li><li> 부드럽게 하향 각도에서 공막엔을 통해 혈관이없는 상태 영역에서 결막을 통해 유리 micropipette의 끝부분을 삽입합니다. 피펫은 공막엔을 침투하면 작은 '팝업'을 생각해야합니다. 약간 아래쪽 각도에서 피펫을 삽입하면 바늘을 삽입시 렌즈를 누르 기회를 줄일 수 있습니다. </li><li> 주사기를 들고있는 사람은 이제 주사기에 2 μL 표시 플런저를 우울하여 솔루션의 4 μL를 주입해야합니다. 주사 총 약 저에게 초 정도 소요됩니다. 아주 느린 속도로 주입하는 것은&gt; 3 초 유리 챔버를 통해 솔루션의 초기 확산을 줄일 수 있습니다. 당신함으로써 절차의 성공을 확인, 현미경으로 유리체 챔버를 통해 플러싱 주입 솔루션을 볼 수 있습니다. </li><li> 약 5 초 동안 꾸준한 micropipette을 보유하고 바늘을 삽입했습니다 같은 방향으로, 철회. 결막은 scleral 소중히 밀봉하는 데 도움이 작은 오프닝을 통해 다시 펄럭 것입니다. </li><li> 복구하는 동안 각막 건조를 방지하고 복구 케이지에 동물을 반환하기 위해 안과 눈 연고 (눈물 Naturale PM)로 각막의 표면을 커버. </li><li> 포스트 - 수술 진통제는 동물 보호 기관의 지침에 따라 관리되어야하고, 동물은 신중하게 수술 후 모니터링해야합니다. </li></ol> 5. 선택 시신경 스텀프에서 망막 신경절 세포를 타겟팅 <ol><li> , 시신경 스텀프에 추적기, 약물, plasmids, siRNAs 또는 바이러스성 벡터를 적용 axotomy에 따라 직접 역행 수송을 통해 망막 신경절 세포를 대상으로합니다. 이것은 처음 "시신경의 절개 프로토콜"22에 따라 시신경의 절개를 수행하여 수행됩니다. </li><li> 시신경에 gelfoam을 이용하거나, 직접 분사 두이 절차를 수행하는 주요 방법이 있습니다. </li><li> 그것이 이전 axotomy에 우수한 colliculus 일주에 역행 추적기를 주사하여 사전 라벨 망막 신경절 세포에 바람직 시신경에서 실험적 치료를 제공하지만 때 gelfoam 방법은, 추적 역행하는 것과 비슷합니다. 이것은 어떤 경우에의 연결을 추적하는이 실험 물질 또는 그 반대의 역행 전송을 방해할 수 있기 때문에 세포 추적하는 것이 중요합니다. </li><li> 시신경이 절단 직후, 실험 용액에 담가 gelfoam의 작은 조각은 가로로 시신경 스텀프 이상 배치됩니다. 궤도 내용은 다음 자신의 이전 위치로 반환됩니다. 눈은 그것은 시신경의 끝에 이상 남아 있도록, 궤도 속으로 gelfoam의 조각을 밀어 집게를 사용하는 데 필요한 중립 위치로 반환하는 경우. </li><li> 사출 기술은 retrogradely axoplasmic 흐름에 의해 운반되기 위해서는 축삭의 세포질에 액세스할 수 있어야합니다 물질의 전달에 대한 더 효과적입니다. 이것은 siRNAs와 plasmids, 일부 경우에 바이러스 벡터를 포함합니다. 50-10 μL 해밀턴 주사기는 가로로 시신경에 원하는 솔루션을 주입하는 데 사용됩니다. </li><li> 좋은 팁 더몬트 포셉과 시신경의 가장자리 그립. 베벨은 더 이상 표시되지 않습니다 때까지 병렬 신경으로 시신경에 바늘의 끝을 삽입합니다. 삽입된 바늘은 신경에 의해 사방에 쌌다는 것입니다. 짧은 베벨과 바늘이 바람직합니다. </li><li> N되면eedle가 신경에 삽입, 부드럽게 잘 팁 포셉과 신경의 측면을 당기 주사기 사분의 일의 차례가 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 회전하면서 솔루션 중 하나 분기 주입. </li><li> 당신이 바늘의 전체 회전을 완료하고 주사기의 전체 내용을 주입 때까지 단계 5.7을 반복 계속합니다. 최상의 결과를 얻으려면 gastight 10 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 솔루션을 10 μL의 총 주입. </li><li> 신경에서 주사기의 끝부분을 제거합니다. 이 axons의 끝을하여 이해를위한 추가적인 수영장을 형성하므로 궤도 내의 신경에서 refluxed 가지고있는 여분의 주입 유체를 남겨주세요. </li><li> 원래 위치로 궤도 내용을 반환, 상처를 닫고, 그리고 동물이 복구 수 있습니다. </li><li> 포스트 - 수술 진통제는 동물 보호 기관의 지침에 따라 관리되어야하고, 동물은 신중하게 수술 후 모니터링해야합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : Intraocular 주사는 세계 망막의 모든 세포를 대상으로하고, 신경절 세포가 유리 챔버에 인접한 망막의 내면의 연결 계층에 위치하고 있기 때문에 부상 RGCs에게 전달 물질에 대해 잘 작동합니다. RGCs도 직접 가로 시신경 스텀프에 물질을 전달하여 타겟팅할 수 있습니다. Fluorogold retrogradely 표시 RGCs는 그림 1에서 그림과 같이 신경 그루터기에서 펩티드, 약물, 벡터, plasmids, 또는 siRNAs를 사용하여 타겟팅할 수 있습니다. 그림 1A - C는 우수한 colliculus로 Fluorogold 주사에 의해 사전 라벨이 붙지만 RGCs의 somata에 Cy3 레이블 펩타이드의 지방화를 보여줍니다. Cy3 분류 펩티드는 즉시 axotomy 후 시신경로 주입되었고, 망막은 고정 기간 동안 조직의 밖으로 침출에서 펩티드를 방지하기 위해 살아있는 몇 군데했다. 그림 1D - F는 Cy3 표시 siRNAs와 axotomized RGCs에 Fluorogold 역행 추적의 지방화를 보여줍니다. Cy3 표시 siRNAs은 즉시 axotomy 후 시신경 스텀프에 주입되었고, 망막이 살아있는 몇 군데했습니다. <img src="/files/ftp_upload/2261/2261fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 시신경 스텀프로 분류 펩티드 또는 siRNAs 중 하나 axotomy 및 주사 후 1 일 flatmounted 망막에 RGCs의 Epifluorescence micrographs. (A) Fluorogold 역행 1 일 postaxotomy에서 axotomized RGCs의 라벨 (B) 표시 펩티드의 역행 교통, 시신경에 axotomy 및 펩타이드 주사 후 일일 다음 RGCs에 Cy3 형광. 의 (C) 중첩 (A)와 (B) Fluorogold 표시 RGCs에 Cy3 레이블 펩티드의 선택 지방화를 시연. (DF) Fluorogold 표시 RGCs (D)의 세포 기관은 또한 오버레이 (F)로 표시 24시간 이전 시신경 스텀프에 주입 Cy3 레이블 siRNAs (E), 가득합니다. AC의 스케일 바에는 50 μm의 수 있습니다. DF의 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

시신경의 절개면은 성인 CNS의 신경 세포의 apoptosis의 높은 재현성 모델입니다. 이 원고에서 보여준 실험 조작은 부상 후 RGC apoptosis의 메커니즘 연구를 허용합니다. Intraocular 주사는 망막의 전세계를 타겟하는 데 유용합니다. 그것이 유리 피펫의 끝에있는 렌즈를 다치게하지 않는 것이 중요합니다 같은이 절차는 연습이 필요합니다. 렌즈 손상은 세포 생존과 재생 20, 21을 변경, 성장 요인의 출시를 일으키는 것으로 표시되었습니다. 신중하게 삽입 및 팁의 방향에 유리 피펫의 병렬를 철회하는 것도 중요하다. 유리 피펫의 끝에 모든 측면 힘이 렌즈 또는 망막 손상을 유리체 챔버를 입력 유리 조각을 일으킬 수 있습니다. 너무 괜찮 팁있는 피펫을 사용하면 점성 솔루션의 배달을 허용하지 않을 수 있습니다. 공막엔 실수로 렌즈를 펑쳐링의 기회를 증가 구멍을 때 또한 매우 훌륭한 조언 촉각 피드백을 제공하지 않습니다. 현미경으로 관찰하면 렌즈는...

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Erratum: Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

<table><tbody><tr><td>정위 고정기</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>쥐용 가스 마스크</td><td>Stoelting Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마취 시스템</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (&lt;sup&gt;Pr&lt;/sup&gt;AErrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>DIN 02225875</td><td></td></tr><tr><td>수술용 현미경</td><td>WPI, Zeiss, Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcaine 점안액</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tears Naturale P.M.</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미세 팁 Dumont 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l Hamilton 시린지 (1701RN; 26s/2&amp;#8221;/2)</td><td>Hamilton Co</td><td>80030</td><td></td></tr><tr><td>1/16 inch 압축 피팅</td><td>Hamilton Co</td><td>55751-01</td><td></td></tr><tr><td>1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK 튜빙</td><td>Supelco, Sigma-Aldrich</td><td>Z226661</td><td></td></tr><tr><td>Dual RN 유리 커플러</td><td>Hamilton Co</td><td>55752-01</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일 프라이밍 키트: 시린지, 바늘, 고무 격막 포함</td><td>Hamilton Co</td><td>PRMKIT</td><td></td></tr></tbody></table>

포유류의 cns에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

Methods for Experimental Manipulations after Optic Nerve Transection in the Mammalian CNS

망막 신경절 세포 (RGCs)는 CNS의 뉴런되는 시신경을 통해 뇌로 망막의 출력 영상 정보. 시신경은 안구의 궤도 내에서 액세스하고 완전히 전체 인구의 RGC axons를 절단 (axotomized) 그었 수 있습니다. 시신경의 절개면은 성인 CNS 1-4에서 apoptotic 세포의 연결을 죽음의 재현성 모델입니다. 눈 유리체 챔버가 intraocular 주사를 통해 실험 조작을 허용, 망막에 약물 전달 캡슐 역할을하기 때문에이 모델은 특히 매력적입니다. 유리 체액을 통해 화학 물질의 확산들은 전체 인구 RGC에 따라 행동을 보장합니다. 바이러스성 벡터, plasmids 또는 짧은 방해 RNAS는 (siRNAs)도 5-12를 망막 세포를 감염 또는 transfect하기 위해 유리 챔버로 전달하실 수 있습니다. Adeno - 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 높은 tropism은 주사 사이트 6, 7, 13-15 가까운 세포의 90 %를 접근 감염 속도와 대상 RGCs에 유용합니다. 또한, RGCs은 선택적으로 그들의 목표 우수한 colliculus 10으로 시신경 16-19 또는 주입 벡터의 컷 끝까지 siRNAs, plasmids, 또는 바이러스성 벡터를 적용하여 transfected 수 있습니다. 이것은 연구자들이 다른 방관자의 뉴런이나 주변 glia에 혼란함을 주죠 효과없이 부상의 연결 인구 apoptotic 메커니즘을 공부하실 수 있습니다. RGC apoptosis는 세포 죽음은 세포가 빠르게 타락한 이후 3~4일의 postaxotomy을 지연 의하여 시간 코스 특성이 있습니다. 이것은 apoptosis에 관련된 경로에 대한 이동 실험 조작에 창을 제공합니다. 직접 가로 시신경 스텀프에서 RGCs를 대상으로 노는 즉시 신경을 절단 후, axotomy의 시간에 수행됩니다. 대조적으로, 물질 intraocular 경로를 통해 전달하는 경우, 그들은 axotomized RGCs에서 apoptosis의 개시를 이전, 이전에 수술이나 수술 후 첫 3 일 이내에 주입 수 있습니다. 현재 기사에서 우리는 시신경의 절개 후 실험 조작을위한 여러 가지 방법을 보여줍니다.

시신경의 절개면은 성인 CNS 손상의 널리 사용되는 모델입니다. 이 모델은 전 세계적으로 망막을 대상에 직접 망막 신경절 세포의 부상의 연결 인구를 대상으로 실험 조작의 번호를 수행하는 데 이상적입니다.

포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

망막 신경절 세포(Retinal ganglion cells, RGCs)는 망막의 시각 정보를 시신경을 통해 뇌로 전달하는 중추신경계(CNS) 뉴런입니다. 시신경은 ...

망막 신경절 세포(Retinal ganglion cells, RGCs)는 시신경을 통해 망막에서 뇌로 시각 정보를 전달하는 중추신경계 뉴런입니다. 동반 영상에서는 성인 중추신경계의 세포사멸성 신경세포 사멸 모델로서 전체 RGC 집단의 축삭을 절단하는 축삭 절단(axotomy) 방법이 시연되었습니다. 본 과정에서는 이 방법이 신경영양인자, 짧은 간섭 RNA(short interfering RNAs), 플라스미드 또는 항세포사멸 단백질을 인코딩하는 바이러스 벡터를 손상된 망막 신경절 세포에 직접 전달하거나, 망막 전체를 대상으로 전달하는 절차와 결합되어 설명됩니다.망막 신경절 세포를 구체적으로 표적하기 위해 안구 내 주입 장치를 조립하고 이를 사용하여 눈의 유리체강으로 물질을 주입합니다. Gelfoam을 배치하거나 Hamilton 주사기를 사용하여 시신경으로 물질을 주입합니다. 신경단면 영상 결과는 항-세포사멸 인자의 전달을 통해 망막 신경절 세포의 생존율을 높일 수 있음을 보여줍니다.이러한 기술을 사용하여, 본 방법은 중추신경계의 성체 뉴런 세포 사멸에 관여하는 단백질을 식별하는 데 활용될 수 있습니다. 시신경 절단은 성체 중추신경계(CNS) 내 뉴런 세포 사멸의 재현 가능한 모델이므로, 이 기술의 함의는 중추신경계 질환의 치료 또는 진단으로 확장됩니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 연구자들은 유리 피펫을 안구의 유리체강에 삽입할 때 수정체에 손상을 입혀 어려움을 겪습니다. 안구 내 주사를 위한 주사기 시스템을 준비하려면, 먼저 바늘이나 RN 너트를 제거하는 것으로 시작하십시오.10 µL RN 가스 타이트 1701 Hamilton 시린지에 준비합니다. PFA 페룰을 압축 피팅의 피크 컵 페룰에 삽입하십시오. 그런 다음 완성된 피팅을 시린지의 끝부분에 삽입하고 RN 너트를 위쪽으로 느슨하게 조입니다.1/16인치 peak 튜브의 한쪽 끝을 RN 너트의 개구부를 통해 압축 피팅에 삽입합니다. peak 튜브가 완전히 안착되었는지 확인하십시오. RN 너트를 조여 페룰을 압착함으로써 peak 튜브를 밀봉합니다.dual RN glass coupler의 양 끝단에 이 과정을 반복하십시오. RN 너트를 조여 peak tubing의 자유단을 dual RN glass coupler의 한쪽 끝에 연결합니다. 유리 마이크로 피펫은 주입 시스템의 바늘과 배럴 역할을 하게 됩니다.유리 피펫을 이중 RN 유리 커플러의 자유단에 삽입합니다. RN 너트를 조여 피펫을 고정합니다. 해부 현미경 하에서, 당겨진 마이크로 피펫을 비스듬히 잡고 유리 슬라이드의 프로스티드 글래스 부분을 따라 팁을 문질러 파손시켜 적절한 직경의 팁을 만듭니다.이상적으로 최종 팁은 약간 경사지게 깎여 있어야 합니다. 다음으로, 시린지, 피크 튜브 링커, 듀얼 RN 유리 커플러, 그리고 미네랄 오일이 채워진 유리 마이크로 피펫이 포함된 Hamilton Syringe Company의 프라이밍 키트를 사용하여 사용 준비를 합니다. 유압 주입 시스템의 경우, 바늘을 Hamilton 9 0 0 3 0 바늘로 교체하십시오.다음으로 미네랄 오일을 주입하는 동안 밀봉 상태를 유지할 수 있도록 Hamilton 9 0 0 3 0 바늘 위에 고무 격막을 씌웁니다. 프라이밍 시린지의 Hamilton 9 0 0 3 0 바늘을 주입 시스템의 10 µL Hamilton 시린지 배럴 뒷부분에 삽입합니다. 격막을 시린지 끝단에 단단히 밀착시켜 밀봉합니다.플런저를 천천히 눌러 미네랄 오일이 주입 시스템의 유리 소자들을 통과하게 합니다. 유리 피펫을 채웁니다. 경로상의 모든 기포를 제거하기 위해 오일을 주입 시스템 전체에 통과시킵니다.충전용 시린지의 미네랄 오일이 소진되고 있다면, 오일을 지속적으로 분사하면서 바늘을 천천히 뽑으십시오. 기포 형성을 방지하려면 프라이밍 시린지를 다시 채운 후 다시 주입하십시오. 전체 시스템이 미네랄 오일로 채워지면, 10 µL 시린지의 원래 플런저를 삽입하십시오.Hamilton 시린지의 플런저를 완전히 눌러 시스템에서 추가 미네랄 오일을 제거합니다. 유리 마이크로 피펫과 시린지 끝부분을 깨끗이 닦아냅니다. 70% ethanol을 사용하여 배럴의 2 µL 표시선까지 플런저를 당겨 취합니다.유리 마이크로 피펫의 끝부분은 공기로 채워져 미네랄 오일과 주입될 액체 사이에 완충 지대를 형성하게 됩니다. 마이크로 피펫의 끝을 원하는 용액에 넣고 Hamilton 주사기의 플런저를 당겨 피펫 배럴을 채우십시오. 안구 내 주입을 수행하기 위해 성체 쥐의 눈에 주입되는 용액의 양은 4~5 µL를 초과하지 않아야 합니다.먼저 가스 흐름을 정위 고정 프레임의 가스 마스크 어태치먼트로 전환하십시오. 그다음 isof fluorine으로 마취된 쥐를 정위 고정 장치에 배치하십시오. isof fluorine 농도를 2%로 낮추고 마취 상태를 모니터링하십시오.동물을 수술용 담요로 덮어줍니다. 수술 전 과정 동안 체온을 유지하기 위해 눈꺼풀을 열고 각막 표면에 마취액 한 방울을 떨어뜨립니다. 유리 피펫을 유리체강에 삽입하고 피펫의 위치를 유지하는 사람이 필요하므로, 주입 과정에는 두 명의 작업자가 필요합니다.그리고 다른 한 손으로는 주사기의 플런저를 눌러 원하는 용액을 주입합니다. 수술용 현미경 하에서 유리 마이크로 피펫과 이중 RN 유리 커플러를 잡고, 주입 지점 반대편의 눈꺼풀을 V자로 벌립니다. 손가락을 사용하여 안구를 안와 밖으로 들어 올립니다. 혈관이 없는 부위의 공막을 통해 유리 마이크로 피펫의 팁을 아래쪽 각도로 조심스럽게 삽입합니다.피펫이 공막을 관통할 때 가벼운 팝 소리(pop)와 함께 느낌이 전달됩니다. 이때 시린지를 잡고 있는 사람이 플런저를 시린지의 2 µL 표시선까지 눌러 4 µL의 용액을 주입해야 합니다. 주입 시간은 약 1~2초 정도 소요되어야 합니다.성공적으로 주입된 용액이 유리체강 전체로 퍼지도록 하고, 마이크로 피펫을 약 5초 동안 안정적으로 유지한 다음, 바늘이 삽입되었던 방향과 동일한 방향으로 천천히 제거합니다. 그러면 결막이 작은 개구부 위로 다시 덮이면서 공막 천자 부위가 밀폐되도록 도와줍니다. 수술이 완료되면 이소플루란(isof fluorine) 투여를 중단하고 동물이 수 분 동안 산소를 흡입할 수 있게 합니다. 회복 과정 중 각막 건조를 방지하기 위해 각막 표면에 안연고를 도포한 후, 동물을 정위 고정 장치에서 분리하여 회복 케이지로 옮깁니다.안구 적출술 후 역행성 수송을 통해 망막 신경절 세포를 조작하려면, 먼저 동반 영상인 시신경 절단 프로토콜, 2, 2 4, 1 추적제 약물 지침에 따라 시신경 절단을 수행하십시오. 플라스미드, siRNA 또는 바이러스 벡터를 시신경 단단면에 적용할 수 있습니다.이 절차를 수행하기 위해 젤 폼(gel foam)을 사용하거나 시신경에 직접 주입하는 두 가지 주요 방법이 있습니다. 젤 폼 방법을 사용하는 경우, 분류학적 분석 일주일 전에 상구(superior colliculus)에 역행 추적자를 주입하여 망막 신경절 세포가 미리 표지되었는지 확인하십시오. 시신경을 절단한 직후, 실험 용액에 적신 소량의 젤 폼 조각을 절단된 시신경 단단 위에 놓고, 안와 내용물을 이전 위치로 되돌립니다.안구를 중립 위치로 되돌린 후, 포셉을 사용하여 젤 폼 조각을 안와 안으로 밀어 넣어 시신경 끝부분을 계속 덮고 있도록 합니다. 이 주입 기술은 액포성 흐름(axoplasmic flow)에 의해 역행 수송되기 위해 축삭의 세포질에 도달해야 하는 물질을 전달하는 데 더 효과적입니다. 절단된 시신경에 원하는 용액을 주입하기 위해 정밀한 10 µL Hamilton 시린지를 사용합니다. 베벨(bevel) 길이가 짧은 바늘을 사용하는 것이 바람직합니다.주입할 용액 10 µL를 시린지에 충전합니다. 일반적으로 주입 대상은 irna 플라스미드 또는 바이러스 벡터입니다. 미세 팁 dumont 핀셋으로 시신경의 가장자리를 잡습니다. 바늘 끝을 시신경과 평행하게 시신경 내부로 삽입합니다.베벨이 더 이상 보이지 않을 때까지 삽입하면, 삽입된 바늘의 모든 면이 신경에 의해 둘러싸이게 됩니다. 바늘이 삽입되면 미세 팁 포셉으로 신경의 양측을 부드럽게 누른 상태에서, 시린지를 회전시키며 용액의 4분의 1을 주입합니다. 시린지를 시계 방향 또는 반시계 방향으로 4분의 1바퀴 회전시킵니다.바늘이 한 바퀴 완전히 회전하고 주사기의 내용물이 모두 주입될 때까지 이 단계를 계속 반복합니다. 신경에서 주사기 팁을 제거합니다. 신경에서 역류하여 안와 내에 남은 주입액은 축삭 말단에서 흡수될 수 있는 추가적인 저장소 역할을 하므로 그대로 둡니다.안와 내용물을 원래 위치로 되돌리고, 상처 부위를 봉합한 후 동물이 회복될 수 있도록 합니다. 수술 후 동물은 개별 사육해야 합니다. 수술 후 진통제는 해당 시설의 동물 관리 지침에 따라 투여해야 합니다.수술 후에는 권한 담당자와 동물들을 주의 깊게 모니터링해야 합니다. 본 영상에서 보여주는 바와 같이, 절단된 시신경 단단에 펩타이드, 약물, 벡터, 플라스미드 또는 siRNA를 전달함으로써 RGC를 직접적으로 타겟팅할 수 있습니다. 이 대표적인 예시에서는 fluoro gold 역행성 표지를 수행하였으며, SI three 표지 펩타이드를 시신경에 즉시 주입하였습니다.고정 과정 중 펩타이드가 조직 밖으로 유출되는 것을 방지하기 위해 망막의 라이브 이미징을 수행하였습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 시신경에 주입된 SI three 표지 펩타이드는 망막의 RGC 세포체로 역행성 수송되었습니다. 본 예시에서는 SI three 표지 siRNA를 시신경 절단단에 주입하였습니다. 축삭 절단 후 망막의 라이브 이미징을 다시 수행한 결과, 시신경에 주입된 SI three 표지 siRNA가 공국소화(colocalization)에서 나타난 바와 같이 RGCs에 의해 역행성 수송되었음을 확인하였습니다.Fluorgold 역행성 표지법을 사용하여, 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 단 몇 초 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 렌즈가 손상되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 바이러스 입자를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 생물학적 위험 물질 취급에 관한 기관 지침을 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

시신경의 절개면은 성인 CNS 손상의 널리 사용되는 모델입니다. 망막 신경절 세포의 90 퍼센트 (RGCs)은 누구의 axons 완전히 axotomy 후 14 일 이내에 죽는 (axotomy) 그었 있습니​​다. 이 모델은 실험 조작을 쉽게받을 수있는 고도 재현할 수 있습니다.

시신경의 절개 : 중추 신경계에서 신경 세포의 Apoptosis 성인의 모델

이 프로토콜은 망막 신경절 retrogradely 세포, 및 이후 망막 신경절 세포 생존과 apoptosis를 분석하기 위해서는 시신경의 호감 부상을하기 위해 레이블을하는 방법을 보여줍니다. 그것은 녹내장을 포함하여 시신경 신경 장해의 종류에 대한 실험 질병 모델입니다.

망막 신경절 세포의 생존을 공부 시신경의 호감 상해 Murine 모델

이 비디오는 마취된 동물의 시신경에 외과적으로 접근하여 국소 탈수초를 유도하기 위해 리솔레시틴을 정확하게 전달하여 추가 연구를 위한 신경 병리학적 조건을 만드는 절차를 보여줍니다.

리솔레시틴(Lysolecithin)을 이용한 시신경의 국소 탈수초화(local demyelination) 유도

쥐의 시신경에 직접 주입하는 것은 재생 연구에 유용합니다. 우리는 두개골을 열지 않는 쥐의 시신경에 직접 주입하는 최소 침습적 기술을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 수술 합병증을 최소화하고 회복 속도가 빨라집니다.

쥐 시신경에 주입을위한 최소 침습 기술

국소 탈수초화는 리솔레시틴 미세주입을 사용하여 시신경에서 유도됩니다. 시각 유발 전위는 생체 내에서 시각 경로를 따라 신호 전도를 검사하기 위해 시각 피질에 이식된 두개골 전극을 통해 기록됩니다. 이 프로토콜은 전극 이식 및 시신경 미세 주입의 기초가 되는 수술 절차를 자세히 설명합니다.

실험 시신경의 탈수 초화의 쥐 모델에서 시각 유발 전위 기록

망막 신경 절 세포 (RGCs)의 2 차 변성 녹 내장에서 일반적으로 발생합니다. 이 연구 부분 시 신경 transection 위한 혁신적인 수술 접근 방법을 설명합니다. 이 공간 절약 요원 접근의 사용 모델의 응용 범위를 확장 하며 보조 부상 메커니즘의 탐사 RGCs에 새로운...

쥐에 있는 부분 시 신경 Transection: 망막 신경 절 세포의 2 차 변성을 평가 하기 위해 새로운 수술 방식으로 설립 모델

우리는 신경 손상 후 후각 내성 glia (OEG) 신경 재생 능력을 평가하는 체외 모델을 제시한다. 그것은 RGN 축상 및 somatodritic 마커를 분석해서, OEG 단층 및 축 변성의 후속 연구 결과에 축축한 성인 망막 신경절 신경절 뉴런 (RGN)의 공동 문화를 기반으로합니다.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

이 프로토콜의 목표는 아급성 안구 고혈압을 유발하는 변연 혈관 신경총의 360° 열 소작을 기반으로 하는 녹내장 신경 퇴행의 새로운 모델을 특성화하는 것입니다.

설치류의 외과적으로 유도된 녹내장에 대한 Limbal Vascular Plexus의 전체 원형 소작

이 논문은 표준 안과 수술 기법을 사용하여 토끼 모델에서 시신경 압착을 수행하기 위한 자세한 지침을 제시합니다.

토끼 모델에서 시신경 파쇄를 위한 외과적 접근 방식

이 프로토콜은 주사를 위해 쥐의 시신경에 접근하기 위해 경결막 접근법을 사용하는 독특한 기술을 설명합니다.

쥐의 시신경에 주입하기 위한 경결막 접근법

학습하세요 포유류 중추신경계에서 시신경 절단 후 망막신경절세포를 표적하는 실험 방법을. 안내구 주사 장치와 Hamilton 주사기를 활용하여 항아포토시스 인자를 전달하고 신경세포 사멸 메커니즘을 연구합니다.

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