포유류의 CNS에서 시신경의 절개 후 실험에 대한 노는 방법

망막 신경절 세포(Retinal ganglion cells, RGCs)는 시신경을 통해 망막에서 뇌로 시각 정보를 전달하는 중추신경계 뉴런입니다. 동반 영상에서는 성인 중추신경계의 세포사멸성 신경세포 사멸 모델로서 전체 RGC 집단의 축삭을 절단하는 축삭 절단(axotomy) 방법이 시연되었습니다. 본 과정에서는 이 방법이 신경영양인자, 짧은 간섭 RNA(short interfering RNAs), 플라스미드 또는 항세포사멸 단백질을 인코딩하는 바이러스 벡터를 손상된 망막 신경절 세포에 직접 전달하거나, 망막 전체를 대상으로 전달하는 절차와 결합되어 설명됩니다.

망막 신경절 세포를 구체적으로 표적하기 위해 안구 내 주입 장치를 조립하고 이를 사용하여 눈의 유리체강으로 물질을 주입합니다. Gelfoam을 배치하거나 Hamilton 주사기를 사용하여 시신경으로 물질을 주입합니다. 신경단면 영상 결과는 항-세포사멸 인자의 전달을 통해 망막 신경절 세포의 생존율을 높일 수 있음을 보여줍니다.

이러한 기술을 사용하여, 본 방법은 중추신경계의 성체 뉴런 세포 사멸에 관여하는 단백질을 식별하는 데 활용될 수 있습니다. 시신경 절단은 성체 중추신경계(CNS) 내 뉴런 세포 사멸의 재현 가능한 모델이므로, 이 기술의 함의는 중추신경계 질환의 치료 또는 진단으로 확장됩니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 연구자들은 유리 피펫을 안구의 유리체강에 삽입할 때 수정체에 손상을 입혀 어려움을 겪습니다. 안구 내 주사를 위한 주사기 시스템을 준비하려면, 먼저 바늘이나 RN 너트를 제거하는 것으로 시작하십시오.

10 µL RN 가스 타이트 1701 Hamilton 시린지에 준비합니다. PFA 페룰을 압축 피팅의 피크 컵 페룰에 삽입하십시오. 그런 다음 완성된 피팅을 시린지의 끝부분에 삽입하고 RN 너트를 위쪽으로 느슨하게 조입니다.

1/16인치 peak 튜브의 한쪽 끝을 RN 너트의 개구부를 통해 압축 피팅에 삽입합니다. peak 튜브가 완전히 안착되었는지 확인하십시오. RN 너트를 조여 페룰을 압착함으로써 peak 튜브를 밀봉합니다.

dual RN glass coupler의 양 끝단에 이 과정을 반복하십시오. RN 너트를 조여 peak tubing의 자유단을 dual RN glass coupler의 한쪽 끝에 연결합니다. 유리 마이크로 피펫은 주입 시스템의 바늘과 배럴 역할을 하게 됩니다.

유리 피펫을 이중 RN 유리 커플러의 자유단에 삽입합니다. RN 너트를 조여 피펫을 고정합니다. 해부 현미경 하에서, 당겨진 마이크로 피펫을 비스듬히 잡고 유리 슬라이드의 프로스티드 글래스 부분을 따라 팁을 문질러 파손시켜 적절한 직경의 팁을 만듭니다.

이상적으로 최종 팁은 약간 경사지게 깎여 있어야 합니다. 다음으로, 시린지, 피크 튜브 링커, 듀얼 RN 유리 커플러, 그리고 미네랄 오일이 채워진 유리 마이크로 피펫이 포함된 Hamilton Syringe Company의 프라이밍 키트를 사용하여 사용 준비를 합니다. 유압 주입 시스템의 경우, 바늘을 Hamilton 9 0 0 3 0 바늘로 교체하십시오.

다음으로 미네랄 오일을 주입하는 동안 밀봉 상태를 유지할 수 있도록 Hamilton 9 0 0 3 0 바늘 위에 고무 격막을 씌웁니다. 프라이밍 시린지의 Hamilton 9 0 0 3 0 바늘을 주입 시스템의 10 µL Hamilton 시린지 배럴 뒷부분에 삽입합니다. 격막을 시린지 끝단에 단단히 밀착시켜 밀봉합니다.

플런저를 천천히 눌러 미네랄 오일이 주입 시스템의 유리 소자들을 통과하게 합니다. 유리 피펫을 채웁니다. 경로상의 모든 기포를 제거하기 위해 오일을 주입 시스템 전체에 통과시킵니다.

충전용 시린지의 미네랄 오일이 소진되고 있다면, 오일을 지속적으로 분사하면서 바늘을 천천히 뽑으십시오. 기포 형성을 방지하려면 프라이밍 시린지를 다시 채운 후 다시 주입하십시오. 전체 시스템이 미네랄 오일로 채워지면, 10 µL 시린지의 원래 플런저를 삽입하십시오.

Hamilton 시린지의 플런저를 완전히 눌러 시스템에서 추가 미네랄 오일을 제거합니다. 유리 마이크로 피펫과 시린지 끝부분을 깨끗이 닦아냅니다. 70% ethanol을 사용하여 배럴의 2 µL 표시선까지 플런저를 당겨 취합니다.

유리 마이크로 피펫의 끝부분은 공기로 채워져 미네랄 오일과 주입될 액체 사이에 완충 지대를 형성하게 됩니다. 마이크로 피펫의 끝을 원하는 용액에 넣고 Hamilton 주사기의 플런저를 당겨 피펫 배럴을 채우십시오. 안구 내 주입을 수행하기 위해 성체 쥐의 눈에 주입되는 용액의 양은 4~5 µL를 초과하지 않아야 합니다.

먼저 가스 흐름을 정위 고정 프레임의 가스 마스크 어태치먼트로 전환하십시오. 그다음 isof fluorine으로 마취된 쥐를 정위 고정 장치에 배치하십시오. isof fluorine 농도를 2%로 낮추고 마취 상태를 모니터링하십시오.

동물을 수술용 담요로 덮어줍니다. 수술 전 과정 동안 체온을 유지하기 위해 눈꺼풀을 열고 각막 표면에 마취액 한 방울을 떨어뜨립니다. 유리 피펫을 유리체강에 삽입하고 피펫의 위치를 유지하는 사람이 필요하므로, 주입 과정에는 두 명의 작업자가 필요합니다.

그리고 다른 한 손으로는 주사기의 플런저를 눌러 원하는 용액을 주입합니다. 수술용 현미경 하에서 유리 마이크로 피펫과 이중 RN 유리 커플러를 잡고, 주입 지점 반대편의 눈꺼풀을 V자로 벌립니다. 손가락을 사용하여 안구를 안와 밖으로 들어 올립니다. 혈관이 없는 부위의 공막을 통해 유리 마이크로 피펫의 팁을 아래쪽 각도로 조심스럽게 삽입합니다.

피펫이 공막을 관통할 때 가벼운 팝 소리(pop)와 함께 느낌이 전달됩니다. 이때 시린지를 잡고 있는 사람이 플런저를 시린지의 2 µL 표시선까지 눌러 4 µL의 용액을 주입해야 합니다. 주입 시간은 약 1~2초 정도 소요되어야 합니다.

성공적으로 주입된 용액이 유리체강 전체로 퍼지도록 하고, 마이크로 피펫을 약 5초 동안 안정적으로 유지한 다음, 바늘이 삽입되었던 방향과 동일한 방향으로 천천히 제거합니다. 그러면 결막이 작은 개구부 위로 다시 덮이면서 공막 천자 부위가 밀폐되도록 도와줍니다. 수술이 완료되면 이소플루란(isof fluorine) 투여를 중단하고 동물이 수 분 동안 산소를 흡입할 수 있게 합니다. 회복 과정 중 각막 건조를 방지하기 위해 각막 표면에 안연고를 도포한 후, 동물을 정위 고정 장치에서 분리하여 회복 케이지로 옮깁니다.

안구 적출술 후 역행성 수송을 통해 망막 신경절 세포를 조작하려면, 먼저 동반 영상인 시신경 절단 프로토콜, 2, 2 4, 1 추적제 약물 지침에 따라 시신경 절단을 수행하십시오. 플라스미드, siRNA 또는 바이러스 벡터를 시신경 단단면에 적용할 수 있습니다.

이 절차를 수행하기 위해 젤 폼(gel foam)을 사용하거나 시신경에 직접 주입하는 두 가지 주요 방법이 있습니다. 젤 폼 방법을 사용하는 경우, 분류학적 분석 일주일 전에 상구(superior colliculus)에 역행 추적자를 주입하여 망막 신경절 세포가 미리 표지되었는지 확인하십시오. 시신경을 절단한 직후, 실험 용액에 적신 소량의 젤 폼 조각을 절단된 시신경 단단 위에 놓고, 안와 내용물을 이전 위치로 되돌립니다.

안구를 중립 위치로 되돌린 후, 포셉을 사용하여 젤 폼 조각을 안와 안으로 밀어 넣어 시신경 끝부분을 계속 덮고 있도록 합니다. 이 주입 기술은 액포성 흐름(axoplasmic flow)에 의해 역행 수송되기 위해 축삭의 세포질에 도달해야 하는 물질을 전달하는 데 더 효과적입니다. 절단된 시신경에 원하는 용액을 주입하기 위해 정밀한 10 µL Hamilton 시린지를 사용합니다. 베벨(bevel) 길이가 짧은 바늘을 사용하는 것이 바람직합니다.

주입할 용액 10 µL를 시린지에 충전합니다. 일반적으로 주입 대상은 irna 플라스미드 또는 바이러스 벡터입니다. 미세 팁 dumont 핀셋으로 시신경의 가장자리를 잡습니다. 바늘 끝을 시신경과 평행하게 시신경 내부로 삽입합니다.

베벨이 더 이상 보이지 않을 때까지 삽입하면, 삽입된 바늘의 모든 면이 신경에 의해 둘러싸이게 됩니다. 바늘이 삽입되면 미세 팁 포셉으로 신경의 양측을 부드럽게 누른 상태에서, 시린지를 회전시키며 용액의 4분의 1을 주입합니다. 시린지를 시계 방향 또는 반시계 방향으로 4분의 1바퀴 회전시킵니다.

바늘이 한 바퀴 완전히 회전하고 주사기의 내용물이 모두 주입될 때까지 이 단계를 계속 반복합니다. 신경에서 주사기 팁을 제거합니다. 신경에서 역류하여 안와 내에 남은 주입액은 축삭 말단에서 흡수될 수 있는 추가적인 저장소 역할을 하므로 그대로 둡니다.

안와 내용물을 원래 위치로 되돌리고, 상처 부위를 봉합한 후 동물이 회복될 수 있도록 합니다. 수술 후 동물은 개별 사육해야 합니다. 수술 후 진통제는 해당 시설의 동물 관리 지침에 따라 투여해야 합니다.

수술 후에는 권한 담당자와 동물들을 주의 깊게 모니터링해야 합니다. 본 영상에서 보여주는 바와 같이, 절단된 시신경 단단에 펩타이드, 약물, 벡터, 플라스미드 또는 siRNA를 전달함으로써 RGC를 직접적으로 타겟팅할 수 있습니다. 이 대표적인 예시에서는 fluoro gold 역행성 표지를 수행하였으며, SI three 표지 펩타이드를 시신경에 즉시 주입하였습니다.

고정 과정 중 펩타이드가 조직 밖으로 유출되는 것을 방지하기 위해 망막의 라이브 이미징을 수행하였습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 시신경에 주입된 SI three 표지 펩타이드는 망막의 RGC 세포체로 역행성 수송되었습니다. 본 예시에서는 SI three 표지 siRNA를 시신경 절단단에 주입하였습니다. 축삭 절단 후 망막의 라이브 이미징을 다시 수행한 결과, 시신경에 주입된 SI three 표지 siRNA가 공국소화(colocalization)에서 나타난 바와 같이 RGCs에 의해 역행성 수송되었음을 확인하였습니다.

Fluorgold 역행성 표지법을 사용하여, 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 단 몇 초 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 렌즈가 손상되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 바이러스 입자를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 생물학적 위험 물질 취급에 관한 기관 지침을 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오.