고해상도 광섬유 Microendoscopy에 대한 현장에서 세포 이미징

세포 수준 해상도에서 현미경 분석이 필요한 전통적 생물학 및 임상 연구는 순차적인 시간에 연구에서 제거된 개별 샘플과 병렬로 여러 실험을 실행하여 수행되었으며, 광학 현미경에 의한 평가를 위한 지점과 공단면, 다광자 및 2차 조화 현미경은 모두 현장 이미징에 유용한 기술입니다. 필요한 인프라는 레이저 시스템 및 복잡한 광원을 스캔하는 것과 관련하여 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 여기에서 우리는 단 하루 만에 고해상 광섬유 마이크로 내시경 체계를 건설하는 방법을, 5 이하 를 위한 기성품 성분을 사용하여, 000 미국 달러를 설명한다.

이 플랫폼은 이미지 해상도, 시야 및 작동 파장 측면에서 유연성을 제공합니다. 먼저, 광원 광학 필터 렌즈, 광섬유 번들 및 CCD 카메라를 수용할 수 있도록 간단한 epi 형광 현미경 프레임을 조립합니다. 다음으로, CCD 카메라에서 광섬유 다발의 확대 이미지를 형성하는 이미징 렌즈가 설치됩니다.

그런 다음 샘플에 형광 여기광을 제공하기 위해 조명 광학 장치와 함께 LED 소스를 설치합니다. 마지막으로, 조립된 마이크로 내시경을 통해 실시간 이미징을 통해 체외 배양, 생체 내 동물 모델, 인간 피험자를 포함한 형광 표지 샘플의 세포 수준 세부 정보를 확인할 수 있습니다. 컨포칼 또는 다광자 현미경과 같은 기존 방법과 비교할 때 이 기술의 주요 장점은 충분히 간단하고 저렴하여 다양한 분야에서 일하는 연구원들이 신속하게 구현하고 특정 요구 사항에 맞게 맞춤화할 수 있다는 것입니다.

여기에 설명된 고해상도 마이크로 내시경은 조립 및 응용 분야에서 여러 가지 변형이 가능한 기본 구성으로 간주되어야 합니다. 특정 응용 분야에 대한 구성 요소를 선택할 때 형광 현미경 검사와 관련된 형광 농도, 광표백 조명, 강도, 카메라 감도, 게인 및 노출 시간 간의 고유한 관계를 고려하십시오. 이 플랫폼은 형광 조영제로 프로 플라빈과 함께 사용하도록 설계되었지만 다른 형광 염료와 함께 작동하도록 구성할 수 있습니다.

Pro flavin은 피크 흡수 및 방출 파장이 각각 445나노미터와 515나노미터인 밝은 핵 염색제입니다. 다른 조영제를 사용하려면 사용자가 여기 방출을 선택해야 하며, 마이크로 내시경 시스템을 조립하기 위한 이색성 필터는 두 개의 6인치 케이지 로드를 두 개의 1.5인치 케이지 로드에 연결하여 한 쌍의 7.5인치 긴 로드를 형성하는 것으로 시작합니다. 폴드 미러 장치의 한쪽 면에 막대를 나사로 고정한 다음 1인치 직경의 미러를 설치합니다.

그런 다음 4개의 0.5인치 막대를 폴드 미러 장치의 반대쪽 면에 나사로 고정합니다. 두 개의 하단 관통 구멍을 통해 케이지 큐브를 7.5인치 케이지 로드에 밀어 넣습니다. 두 인치 막대를 케이지 큐브의 측면에 나사로 고정합니다.

C 마운트를 SM one 어댑터에 사용하여 카메라를 케이지 플레이트에 부착합니다. 폴드 미러 유닛의 면과 같은 높이가 되도록 0.5인치 케이지 로드의 케이지 플레이트를 고정합니다. 1인치 직경의 튜브 렌즈를 선택하여 카메라에서 광섬유 번들의 이미지를 형성합니다.

렌즈의 초점 거리는 광섬유 다발의 원인이 적어도 두 개의 픽셀로 샘플링되도록 선택되어야 합니다. 카메라에 이미지를 촬영하면 렌즈를 3인치 길이의 렌즈 튜브에 삽입하고 고정 링으로 렌즈를 고정합니다. 스패너 렌치는 긴 렌즈 튜브에 링을 나사로 고정하는 데 도움이 됩니다.

방출 필터를 첫 번째 고정 링 상단의 3인치 렌즈 튜브에 떨어뜨리고 다른 링을 추가하여 필터를 제자리에 고정합니다. 필터 방향이 필터 제조업체에서 지정한 규칙을 충족하는지 확인합니다. 렌즈 튜브를 CCD 카메라에 가장 가까운 케이지 큐브 측면에 나사로 고정합니다.

이 위치는 여기에도 표시됩니다. 다이어그램에서 이 렌즈와 필터는 3인치 렌즈 튜브 없이 표시됩니다. 명확성을 위해 카메라를 컴퓨터에 연결하고 view 화면의 이미지.

케이지 어셈블리를 멀리 있는 물체로 향하게 하고 물체의 이미지가 초점이 맞춰질 때까지 레일을 따라 케이지 큐브를 밉니다. 드라이버를 사용하여 케이지 큐브의 측면에 있는 4개의 나사를 조입니다. 이 나사는 조일 때 레일을 잡고 큐브를 제자리에 고정합니다.

이렇게 하면 튜브 렌즈가 무한 보정 대물 렌즈와 결합될 때 카메라에서 광섬유 번들의 초점이 맞춰진 이미지를 형성할 수 있습니다. 그런 다음 다이크 미러를 홀더에 삽입하고 케이지 큐브에 45도로 놓습니다. RMS to SM 단일 스레드 어댑터와 조정 가능한 렌즈 튜브를 통해 대물 렌즈를 튜브 렌즈 홀더 맞은편에 있는 케이지 큐브 면에 나사로 고정합니다.

그런 다음 SMA 커넥터를 케이지 플레이트에 나사로 고정하고 대물 렌즈의 작동 거리에서 대략 로드에 장착합니다. 베이스 플레이트와 엔드 캡을 케이지 큐브의 열린 면에 추가합니다. 그런 다음 케이지 플레이트에 LED를 장착하고 두 인치 막대 끝에 밀어 넣습니다.

0.5인치 렌즈 튜브에 렌즈를 추가하여 이 튜브가 케이지 큐브 측면에 나사로 고정되면 대물 렌즈의 후면 조리개를 채우는 LED 이미지를 형성합니다. 또한 여기 필터를 렌즈 튜브에 추가합니다. 이 단계에서 LED 드라이버를 사용하여 에폭시를 사용하여 조명 강도를 제어할 수 있습니다.

1030미크론 광섬유용 SMA 커넥터를 720미크론 시야각 광섬유 번들에 연결합니다. 광섬유 커넥터화에 대한 자세한 내용은 T Thor 연구소, 부품 번호 FN nine six를 참조하십시오. 광섬유의 커넥터화 및 연마에 대한 가이드.

SMA 커넥터 눈 번들을 케이지에 장착된 SMA 소켓에 나사로 고정하면 로드가 번들의 말단을 광대역 광원 쪽으로 향하게 하면 형광등으로 충분합니다. 그런 다음 CCD 카메라에서 번들 근위부 얼굴의 이미지를 관찰합니다. 마지막으로 케이지 큐브를 나사로 조이거나 빼서 대물 렌즈의 위치를 조정합니다.

광섬유 다발 이미지에 초점이 맞춰질 때까지 개별 원인이 명확하게 보여야 합니다. 마이크로 내시경의 공간 해상도는 마이크로 렌즈 또는 렌즈 어셈블리를 섬유 다발의 말단 끝에 부착하여 증가시킬 수 있습니다. 이러한 광학 장치는 번들 팁을 조직에 직접 배치하는 대신 dem 배율을 통해 팁 표면을 이미지화하도록 구성됩니다.

따라서 광섬유 다발의 광 안내 원인에 의해 부과되는 공간 샘플링 주파수가 증가합니다. dem 배율의 정도는 공간 해상도의 증가에 해당하며 동시에 시야의 비례적인 감소에 해당합니다. 용도에 맞는 원하는 배율과 working distance를 가진 grin lens를 선택하십시오.

렌즈의 직경이 광섬유 번들의 직경과 일치하는지 확인하십시오. 당신은 함께 일할 계획입니다. 정확한 정렬을 위해 저전력 현미경 또는 입체경 아래의 별도의 3축 수동 포지셔닝 스테이지에 광섬유 번들과 grin 렌즈를 장착합니다.

그런 다음 렌즈 또는 번들 면에 광학 접착제 한 방울을 떨어뜨립니다. 수동 포지셔너를 사용하여 두 구성 요소를 접촉시킵니다. 접착제를 경화시키기 위해 제조업체에서 권장하는 선량으로 계면을 자외선에 노출시킵니다.

grin lens와 bonded interface를 보호하려면 짧은 길이의 알루미늄 모세관 튜브를 사용하여 조인트를 둘러쌉니다. 튜브를 조인트 위로 밀어 넣고 튜브의 양쪽 끝에 에폭시 방울을 떨어뜨려 제자리에 고정하고 열 수축 튜브를 사용하여 어셈블리를 마무리합니다. 마이크로 내시경 이미징 전에 이미징할 세포 또는 조직에 조영제를 적용하여 세포를 이미지화하고 배양합니다.

먼저 peppe로 성장 배지를 제거합니다. 그런 다음 웰에 부드럽게 피펫팅하여 프로 플라빈 용액을 추가합니다. 최대 1분의 짧은 배양 후, peppe로 프로 플라빈 용액을 제거하고 버립니다.

웰에 새로운 PBS 용액을 추가 및 제거하여 세포를 헹굽니다., 안정성을 위해 x, Y, Z 축에 수동 배치 단계가 있는 안전한 고정 장치에 섬유 다발의 말단 끝을 장착합니다. 세포나 조직에 염료를 도포한 후 이미징하는 동안 광섬유 번들을 샘플과 가벼운 접촉에 두십시오. View 카메라 제조업체에서 제공한 소프트웨어 또는 개발하려는 사용자 지정 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 화면에서 광섬유 번들의 이미지를 봅니다.

허용 가능한 밝기의 이미지를 얻기 위해 카메라의 노출 시간과 게인 설정을 조정합니다. 올바르게 조립되면 마이크로 내시경은 코히어런트 광섬유 다발을 통해 전달되는 에피 형광 현미경으로 작동합니다. 최적의 이미징 결과를 얻으려면 세 가지 주요 조건이 충족되는지 확인하는 데 주의를 기울여야 합니다.

먼저, 시스템의 전체 해상도를 달성하기 위해 광섬유 다발의 근위면을 디포커스 없이 CCD 카메라에 이미지화해야 합니다. 여기. 광섬유 다발의 일부는 초점이 좋지 않고 초점이 약간 맞으며 초점이 양호한 상태로 이미지화됩니다. 최적의 초점은 번들 면을 기준으로 대물렌즈의 실제 위치를 조정하여 찾을 수 있습니다.

둘째, 섬유 다발의 근위면은 전체 직경에 걸쳐 균일하게 조명되어야 합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 이는 콜라 조명을 위한 조명 광학 장치를 구성함으로써 달성됩니다. 여기에 표시된 이미지는 균일한 형광 샘플이 이러한 바람직한 구성에서 조명될 때 획득되었습니다.

임계 조명 하에서 해당 결과가 여기에 표시됩니다. LED의 구조는 광섬유 번들 면에 이미지화되어 실제 샘플 구조에 겹쳐진 이 원치 않는 패턴이 나타납니다. 셋째, 섬유 다발의 근위면과 원위면이 모두 깨끗하고 긁힘과 칩이 없어야 합니다.

이 예에서는 이미지 파편이 번들 면에 부착되고 파이버 둘레에서 5시 방향에 작은 칩 형태의 손상이 보입니다. 렌즈 종이와 이소프로판올 또는 표준 광섬유 청소 도구를 사용하여 기존 광섬유 커넥터와 동일한 방식으로 청소하여 번들 면에서 이물질을 제거할 수 있습니다. 1483 세포는 pro flavin으로 표지되고 벌거벗은 섬유 다발을 샘플에 가볍게 놓았습니다.

여기에 표시된 in vitro 이미징은 2.5 x grin 렌즈를 번들 팁에 접착하여 공간 해상도를 개선하고 시야를 줄였습니다. 외경이 0.5mm인 섬유 다발을 21 게이지 바늘에 통과시켜 마우스의 유방 지방 패드 조직으로 전진시키는 생체 내 이미징을 진행한 본 영상에서 본 바와 같이, 심장 주기로 인해 지방세포가 움직임으로 명확하게 보입니다. 이 예시에서는 건강한 인간 지원자의 구강 점막 이미징을 1.5mm 외경의 더 큰 섬유 다발을 사용하여 수행했습니다.

모든 예에서, 표시된 pro flavin은 핵 표지 형광 조영제로 사용되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포와 조직의 In C 2 형광 이미징을 위한 광섬유 마이크로 내시경을 설계하고 조립하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.