Name: 신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 배우세요 신생아 마우스 폐 내피 세포 분리 및 배양 방법을 통해 혈관생성과 혈관투과성 연구에 활용하세요. 이 기술은 항체 결합 자기 비즈를 사용하여 높은 순도의 세포를 얻습니다.

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이 연구는 미국 심장 협회 부여 0950118G.to MC - W에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 안티 PECAM - 1 항체 - 복합 자석 구슬을 준비 (Dynabeads) <ol><li> BSA가 해소 때까지 소용돌이를 사용하여 50 ML PBS에서 50 MG BSA를 혼합하여 PBS에 0.​​1 % BSA를 준비합니다. 0.22 μm의 주사기 필터를 통해 필터링하여 소독. 4 스토어 ° C. </li><li> TC 후드에서 1.5 ML Eppendorf 튜브에 잘 resuspended 양을 안티 쥐 IgG의 Dynabeads 200 μl를 전송하고 구슬을 씻으 : 마운트 튜브를 MPC와 퇴적물에 비즈를 허용하도록 약 1 분 앉아 보자. 뜨는 기음, MPC에서 튜브를 제거하고 멸균 0.1 % BSA / PBS 1 ML에있는 구슬을 resuspend. 구슬을 resuspend하기 위해 아래 피펫합니다. </li><li> 네 세척의 총 세 번 씻어 반복합니다. </li><li> MPC에서 튜브를 제거하고 0.1 % BSA / PBS 500 μl의 구슬을 resuspend. </li><li> 튜브 10 μl 쥐 방지 마우스 PECAM - 1 (CD - 31) 항체를 추가합니다. </li><li> 상온에서 추운 방 또는 2 시간에서 4 ° C에서 하룻밤 텀블. </li><li> 같은 단계 1.2 네 번에서 설명한 멸균 0.1 % BSA / PBS로 비즈를 씻으십시오. </li><li> MPC에서 튜브를 제거하고 200 μl 0.1 % BSA / PBS에있는 구슬을 resuspend. 4 스토어 방지 PECAM - 1 항체 - 복합 Dynabeads 최대 일개월하는 C. </li></ol> 2. 신생아 생쥐에서 분리 폐 내피 세포 마우스 전에 조직 정화 프로토콜과 함께 진행하는 프로 시저의 IACUC위원회의 승인이 필요합니다. <ol><li> 다음 사항을 준비 : <ul><li> DMEM 1 MG / ML C / D 솔루션 15 ML. 37 필터 따뜻한 0.22 μm의 주사기와 필터 ° C. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브 15 ML DMEM, 얼음에 저장과 </li><li> DMEM에 최고 20 % FBS 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함한 절연 미디어 (IM) </li><li> 젤라틴 2%. 4 100 ML DD 물, 압력솥 15 분 저장 ° C.와 소 피부 2g는 ​​젤라틴 믹스 37 따뜻한 ° C 코팅 TC의 flasks 전에 녹일 수 있습니다. </li></ul></li><li> 케타민을 (100 MG / kg)과 xylazine (10 MG / kg)의 IP 주사로 3 6~8일 오래된 새끼를 마취. 다음과 같이 마취의 효과를 확인하고 동물 하나씩 해부하다 : 보드에 핀 새끼는 멸균 해부 가위로 가슴 영역에서 피부를 70 % 에탄올로 피부를 흡수하고 제거합니다. 폐가 노출 엑사이스 갈빗대. </li><li> 무균 엑사이스 개별 폐 엽 (叶), 조심하는 것은 기관지와 폐 주변에 보이는 결합 조직을 해부하다하지. 얼음처럼 차가운 DMEM의 모든 폐를 결합합니다. 새끼를 안락사. </li><li> TC 후드에서 근무 DMEM, 100mm TC 요리의 장소에서 폐 엽 (叶)을 제거하고 여분의 DMEM을 대기음. </li><li> 멸균 가위를 사용하여 ~ 100 번 절단하여 가늘게 조직을 말하다. 효소 소화 15 ML 따뜻한 C / D 솔루션에 전송합니다. 회전에서 37 ° C에서 45 분 알을 품다. </li><li> TC 후드에서 단일 세포 현탁액에 14g​​ 정맥 붙어 씹다 대단히 짧은 시간, 최소한 12 시간을 20 ML의 주사기로 들어가서 소화 조직 현탁액을 대기음. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 조직 현탁액을 통과하고 소화를 중지 15 ML 메신저로 스트레이너 씻으십시오. </li><li> 5 분 400x g에서 원심 분리하여 펠렛의 세포 현탁액. </li><li> 3 ML 0.1 % BSA / PBS에 대기음 뜨는 및 resuspend 펠릿. </li><li> 5 ML 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 22.5 μl 방지 PECAM - 1 항체 - 복합 Dynabeads를 추가합니다. 12분에 대한 실온에서 텀블. </li><li> 코트 2 ML 2퍼센트 젤라틴과 젤라틴 대기음 초과와 T75 플라스크. 이전 도금 세포 ~ 30 분 정도에 대한 TC 후드 내부 건조 젤라틴 수 있습니다. </li><li> 비드 배양이 완료되면 (단계 2.10) 세 Eppendorf 튜브에 동일 세포 현탁액을 분할하여 MPC에 탑재합니다. </li><li> 구슬은 MPC를 (~ 1 분)를 사용하여 sedimented있을 때, 뜨는 수집 MPC에서 튜브를 제거와 구슬을 씻어 ~ 1 ML 0.1 % BSA / PBS 다음 MPC를 탑재. </li><li> 네번 (총 5 세척)을 씻어 반복 </li><li> EnGS - MV 생활 요인 Kit 및 관 당 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (VL)와 VascuLife 1 ML에 Resuspend 구슬이 잘 혼합. </li><li> 미리 코팅 T75 플라스크에 플레이트와 VL 10 ML 각 플라스크 총 볼륨을 가지고. </li><li> 미디어에게 다음날을 변경, 성장의 한 하루를 허용하고 다른 모든 일 미디어의 절반을 변경합니다. 세포 (보통 문화의 3~4일 후)&gt; 70-80% 합류 이상의 경우, 그들은 반 ICAM - 2 Dynabeads와 함께 정렬할 수 있습니다. </li></ol> 3. 준비 방지 ICAM - 2 항체 - 복합 Dynabeads <ol><li> 안티 ICAM - 2 항체 - 복합 Dynabeads가 추가 합류 때까지 반 PECAM - 1 Dynabeads 항체 - 복합과 교양과 선택되어 세포를 정화하는 데 사용됩니다. 이 절차는 그 반대 마우스 ICAM - 2 (CD - 102)가 항체가 백신 PECAM - 1 항체 대신 사용 제외하고, 안티 PECAM - 1 항체 - 복합 Dynabeads (1 위)에 대한 설명으로 수행됩니다. </li><li> 안티 ICAM - 2 항체 - 복합 Dynabeads는 ° C 최대 4 저장할 수 있습니다일개월 수 있습니다. </li></ol> 4. 안티 ICAM - 2 Dynabeads와 마우스 폐 내피 세포 정렬 <ol><li> 2퍼센트 젤라틴과 코트 T75 조직 문화 플라스크. </li><li> 세포와 합류 T75 술병에서 미디어를 대기음 8 ML PBS로 세척. </li><li> 대기음 PBS, 2 ML 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 (5 분) 세포가 분리하자. 분리 원조로 가볍게 flasks을 누릅니다. </li><li> 세포가 분리되면 남아있는 자기편 세포를 분리하는 트립신과 다쳤고, 세포를 억제 2 ML IM를 추가합니다. 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 400x G.에서 5 분 스핀 다운 </li><li> 2 ML 0.1 % BSA / PBS에있는 미디어 및 resuspend 세포 펠렛을 대기음. </li><li> 5 ML의 폴리스티렌 왕복 아래 튜브로 환승 10 μl 방지 ICAM - 2 Dynabeads를 추가합니다. RT 12 분 텀블. </li><li> MPC 두 1.5 ML Eppendorf 튜브 및 마운트에 세포 현탁액을 분할. </li><li> 구슬 한 분만 준수 후에 뜨는을 대기음. MPC에서 튜브를 제거하고 1 ML 0.1 % BSA / PBS에 각 튜브를 resuspend. MPC에 리마운트. </li><li> 네 번 (5 씻어 총) 씻어 반복합니다. </li><li> 1 ML VL 각 튜브를 Resuspend 및 셀 개수를 수행합니다. </li><li> T25 플라스크 및 / 또는 T75 플라스크 당 750K - 1000000 세포 당 250 350K 전지에서 플레이트 세포. </li><li> T25 flasks 5 ML의 VL, 그리고 T75 flasks 10 ML에 볼륨을 가져와. </li><li> 매일 미디어를 변경합니다. 문화가 보통 2~3일에 약 80 % confluency에 도달하면 세포는 실험을 위해 사용될 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 일반적으로 세포의 초기 준비 6-7일 후, 우리는 1.2에 대해 얻을 수 있습니다 - 셋 6~8일 오래된 새끼에서 1.5 X 10 6 폐 내피 세포는. 세포는 빛을 현미경 아래에 전형적인 "조약돌"형태를 표시하고 내피 세포 (그림 1)에 대한 특징입니다 VE - cadherin (CD144) 세포 세포 분기점에서 얼룩을 보여줍니다. MLECs 표현 VE - cadherin과 VEGFR2의 대부분은 외과 분석 (그림 2)에서 보여주었다. 보통, 우리는 초기 MLEC 격리 이후 두 주 이내에 실험에 사용합니다. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 합류 MLEC의 monolayer의 미세 분석. (A) 라이트 현미경 이미지는 내피 세포에 대한 전형적인 교양 세포의 조약돌 형태를 보여줍니다. 많은 세포의 perinuclear 지역에 위치하고 균일한 원형 구조는 MLEC 절연에 사용되는 자성 비즈입니다. (B) 내피 특정 VE - cadherin은 같은 공촛점 현미경을 사용하여 표시된 셀 전지 분기점에서화된입니다. 바 20μm의 대표입니다. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2 내피 특정 마커에 대한 특정 항체로 분류 교양 MLECs의 외과 분석 :. phycoerythrin - 복합 이차 항체 다음 VE - cadherin (CD144) 또는 VEGFR2로 기소, 절연 MLECs의 내피 신원을 확인합니다. 레드 라인 isotype 특정 컨트롤을 나타냅니다, 녹색 라인은 나타냅니다 방지 VE - cadherin 또는 방지 VEGFR2 - 특정 - IgG.

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</ol>

동물 실험 프로토콜 AUA # 00001206 이하 위스콘신 IACUC위원회의 메디컬 칼리지에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

Microvascular 항법은 혈관 생물학의 여러 분야에서 유용한 모델로 입증하고 널리 공부 HUVECs 세 이상 (예 : angiogenesis) 공부에 더 생리학 관련성이 높은 것으로하고 있습니다. 이전, 그것은 microvascular 내장 컴퓨터가 신장, 심장, 피부, 망막, 뇌, gliomas, 지방 조직뿐만 아니라 폐 2, 4-7, 10, 11에서 구할 수있는 것으로보고되었습니다. 그러나, microvascular 내장 컴퓨터의 격리에 대한 일관성 있고 신뢰할 수있는 방법은 여전히​​ 필요합니다. 여기에 제시 절차는 이전에 게시된 프로토콜 2의 수정이며 그것이 새끼 대신 성인 동물을 사용하는 대부분의 출판 절차와는 다릅니다. 어린 동물에서 세포가 높은 확산 가능성을 가지고 자신의 조직에서 파생된 문화가 세포의 높은 숫자를 얻을하는 경향으로 이것은 절연 성공을 위해 매우 중요합니다. 일주일 오래된 동물 최적으로 보이지만, 어린 생쥐 (하루 지난 4)도 사용할 수 있습니다. 우리는 하나 펍에서 MLECs를 분리에 성공으로도, 새끼의 높거나 낮은 숫자는 필요한 경우 사용할 수 있습니다. 그러나, 격리 프로세스를 확장 또는 아래 반면, 세포 도금 밀도는 또한 세포 증식에​​ 중요로 변경되어 있어야합니다. 안티 PECAM - 1 최초로 복합 자기 구슬을 사용하여 MLECs 및 방지 ICAM - 2 항체보다 2 단계 정화 과정은 앞에서 설명한 단일 단계 정화 절차를보다 순수한 EC 문화를 얻는에 훨씬 효율적입니다. 이 프로토콜은 매우 힘드는 매뉴얼 기술, 기울기 원심 분리 및 섬유아 세포, 혈액 세포 및 평활근 세포로 폐기 오염 전지 정렬 덜 효율적인 외과를 사용할 필요가 없습니다. 그 결과 MLEC 인구는 angiogenic 반응, 혈관 투과성 및 백혈구 윤회의 체외 분석, 치료뿐만 아니라 신호 경로의 생화 학적 분석을 상처를 사용할 수 있습니다. 필요한 경우, MLECs 그러한 횡단 내피 저항 (터) 측정 immunofluorescence 또는 전극 어레이에 대한 fibronectin이나 젤라틴 코팅 coverslips 등 다양한 표면에 도금 수 있습니다. 얻은 결과는 직접 녹아웃 및 유전자 변형 마우스 라인의 증가의 맥락에서 특히 중요합니다 생체내에서 관찰 phenotypes 비교할 수 있습니다. 생체내에서 관찰된 결함을 기본 세포 구조의 체외 분석에이 방법의 성공적인 구현은 이미 12를 발표했습니다.

<table><tbody><tr><td>스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15032-13</td><td></td></tr><tr><td>포셉</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>14G 캐뉼라</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482516N</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110.35</td><td></td></tr><tr><td>자기 입자 농축기 (MPC)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse PECAM-1 항체 (CD-31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553369</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse ICAM-2 항체 (CD-102)</td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase/Dispase (C/D)</td><td>Roche Group</td><td>11097113001</td><td>100mg/ml 스톡 용액을 제조하여 -20&amp;#x00B0;C에서 보관할 수 있음</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>우피 젤라틴 (Bovine Skin Gelatin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vasculife EnGS-Mv 완전 키트 (VL)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL0004</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin/EDTA</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>세포 스트레이너 70 &amp;mu;m 나일론</td><td>Falcon BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

내피 세포는 혈관 생물학의 여러 분야에서 유용한 연구 모델을 제공합니다. 처음으로 고립 1 일 이후, 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs) 가장 널리 연구 내피 세포 수 있습니다 따라서, 구하는 문화를 쉽고 편리하게하는 표시하고 있습니다. 그러나, angiogenesis, 투자율이나 많은 사람과 같은 프로세스에 초점을 맞춘 연구, microvascular 내피 세포 (내장 컴퓨터 시스템)은 2 연구 훨씬 더 생리학 관련성이 높은 모델입니다. 또한, 녹아웃 마우스에서 분리된 내장 컴퓨터 단백질 기능의 예 생체내 분석을위한 유용한 도구를 제공합니다. 몇 가지 접근 방법은 격리와 문화 microvascular 다른 원산지의 항법 것은 날짜를 3-7로보고 있지만, 순수 항법의 일관성 고립과 문화는 여전히 많은 실험실에서 중요한 기술적 문제되었습니다. 여기서 우리는 분리하고 culturing 마우스 폐 내피 세포 (MLECs)의 안정적이고 비교적 간단한 방법에 대한 단계별 절차를 제공합니다. 이 방법에서는 폐 조직은 6에서 얻은 - 오래된 새끼가 처음 collagenase / dispase (C / D) 솔루션과 함께 소화, 조각으로 절단 및 단일 세포 현탁액으로 기계적 분산됩니다 8 일 수 있습니다. MLECS은 자기 입자 농축기 (MPC)를 사용 Dynabeads에 복합 백신 PECAM - 1 항체와 긍정적인 선택을 사용하여 세포 현탁액에서 정화 수 있습니다. 그들이 합류되기 전까지는 이러한 정화 세포 (TC) 요리 젤라틴 코팅 조직 문화에 양식 있습니다. 그 시점에서, 세포는 더 이상 반 ICAM - 2 항체에 결합 Dynabeads를 사용하여 정화하고 있습니다. 이 프로토콜과 함께 얻은 MLECs는 위상 대비 가벼운 현미경에 의해 같은 시각 코블스톤 표현형을 전시, 그들의 내피 표현형는 안티 - VE - cadherin 8 방지 VEGFR2 9 항체 및 VE - cadherin의 immunofluorescent 얼룩과 외과 분석을 사용하여 확인되었습니다. 우리 손에,이 두 단계 절연 절차는 지속적으로 안정 추가로 교양 수 MLECs의 순수한 인구를 산출. 이 방법은 연구자가 녹아웃 직접 격리 MLECs에서 수행 체외 실험에서 결과와 생체내 연구에 연관시키는 유전자 변형 생쥐의 증가를 활용하기 때문에 생체내에서 관찰 혈관 phenotypes의 분자 메커니즘을 공개하는 데 도움이있게됩니다.

여기, 우리는 murine 폐동맥 내피 세포의 격리와 문화 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 정비사 및 효소 폐 조직 분리뿐만 아니라 안티 - PECAM - 1과 대부분 microvascular 원산지 순수한 내피 세포 인구를 생산 자성 비즈에 복합 백신 ICAM - 2 항체를 사용하여 2 단계 정화 과정으로 구성됩니다.

혈관 내피세포는 혈관 생물학의 많은 분야에서 유용한 연구 모델을 제공합니다. 최초로 분리된 이후로, 인간 제대 정맥 내피세포는...

본 절차의 전반적인 목적은 신생 생쥐의 폐에서 폐 혈관내피세포를 분리하고 배양하는 것입니다. 이는 먼저 갓 채취한 폐로부터 균질한 세포 현탁액을 만들어 수행합니다. 최종적으로 조직을 잘게 다진 후 효소 소화를 진행하고, anti P chem one 항체가 접합된 자성 비드를 사용하여 혈관내피세포를 농축합니다.CETA 배양을 통해 혈관 내피세포 집단을 정제합니다. 이어서 anti I chem two 항체가 결합된 자성 비즈를 사용하여 이 세포들을 젤라틴 코팅 플라스크에서 증폭시킵니다. 이렇게 얻은 일차 폐혈관 내피세포는 대부분 미세혈관 기원이며 TERRIN 및 VEGF R two와 같은 특이적 혈관 내피세포 마커를 발현합니다.이 기술의 기존 방법(siRNA 유전자 억제 등) 대비 주요 장점은 형질전환 생쥐를 활용하여 유전적으로 변형된 혈관내피세포를 얻을 수 있다는 점입니다. 또한, 이 기술로 얻은 혈관내피세포는 대부분 미세혈관 기원이므로, 일부 혈관 연구 분야에서 더 높은 관련성을 가질 수 있습니다. 이 방법으로 얻은 혈관내피세포는 혈관신생 및 혈관 투과성의 분자적 기전과 같은 혈관 생물학 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.조직 수확 소화 및 비드 결합 세포 세척 단계는 습득하기 어렵기 때문에 이 기술의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 이 기술을 부적절하게 수행하면 내피세포가 아닌 세포의 오염이 발생하거나 세포 수율 및 성장률이 저하될 수 있습니다. 이 dyna beads 프로토콜을 위해 PBS에 0.1%BSA 50 milliliters를 준비하고, BSA가 녹을 때까지 볼텍싱하여 혼합한 후 0.22 micron 시린지 필터로 용액을 여과하여 멸균하십시오.조직 배양 후드 내에서 멸균 조건하에 sheep anti-rat IgG dynabeads를 재현탁한 후, 200 µL를 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 옮깁니다. 비드를 세척하기 위해 튜브를 자기 입자 농축기(MPC)에 장착하고 비드가 가라앉을 때까지 1분간 기다린 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 튜브를 MPC에서 분리하고 멸균된 0.1% BSA-PBS 1 mL에 비드를 다시 현탁합니다.네 번째 세척 후 이 세척 과정을 세 번 더 반복하십시오. 튜브를 MPC 및 Resus에서 제거하십시오. 비즈를 500 microliters의 0.1%B-S-A-P-B-S에 현탁하십시오.앞서 설명한 것과 같이 튜브에 rat anti mouse pcam one 항체 10 µL를 넣고 실온에서 2시간 동안 텀블링합니다. 멸균된 0.1% B-S-A-P-B-S로 비드를 4회 세척합니다. MPC에서 튜브를 꺼내어 재현탁합니다.비즈를 200 µL의 0.1% BSA-PBS에 보관하십시오. 이렇게 준비된 anti P chem one 항체 결합 dyna beads는 4 °C에서 보관합니다. 일차 세포를 얻기 위해, 생후 6-8일 된 새끼 쥐 3마리를 마취하십시오.포셉으로 꼬리를 집어 마취 효과를 확인하십시오. 동물을 순차적으로 해부합니다. 먼저 새끼 쥐를 보드에 고정하고 흉부 부위의 피부를 제거하십시오.해부 가위로 흉곽을 절제하여 폐를 노출시킵니다. 이제 무균적으로 각각의 폐엽을 절제합니다. 이때 기관지나 폐 주변에 보이는 결합 조직을 절제하지 않도록 주의하십시오.안락사시킨 새끼 쥐의 모든 폐를 얼음처럼 차가운 DMEM에 함께 넣습니다. 이제 조직 배양 후드로 이동합니다. DMEM에서 폐엽을 꺼내 100mm 조직 배양 접시에 넣습니다.멸균 가위로 조직을 잘게 다진 후 과잉의 DMEM을 흡입하여 제거하십시오. 효소 소화를 위해 약 100회 정도 자릅니다. 준비된 조직을 15 milliliters의 따뜻한 collagenase 분해 용액으로 옮기고, 14 gauge cannula가 연결된 20 milliliter 주사기를 사용하여 회전기(rotator)에서 37 degrees Celsius로 45분 동안 배양하십시오. 소화된 조직 덩어리를 단일 세포 현탁액으로 분리하십시오.이제 세포 현탁액을 70 µm 세포 스트레이너에 통과시키고, 소화 반응을 중단시키기 위해 스트레이너를 15 mL의 Im으로 세척합니다. 폐 세포를 수확하려면 400 ×g에서 5분 동안 원심 분리한 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 3 mL의 0.1% BSA-PBS에 재현탁하여 5 mL 라운드 바텀 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다.혈관 내피 세포를 분리하기 위해, anti P chem one 항체가 결합된 dyna beads 22.5 µL를 첨가하고 실온에서 12분 동안 회전 혼합합니다. 그동안 T 75 플라스크를 2% gelatin 2 mL로 코팅합니다. 과량의 gelatin 용액을 흡입하여 제거하고 조직 배양 후드 내부에서 약 30분 동안 자연 건조시킵니다. 비드 배양이 완료되면, 세포 현탁액을 세 개의 fendor 튜브에 균등하게 나누어 담고 MPC에 장착합니다.MPC 시스템을 사용하여 dyna beads를 약 1 mL의 0.1% B-S-A-P-B-S로 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, 튜브당 1 mL의 VAs life에 beads를 다시 현탁합니다. 모든 튜브를 합쳐 잘 섞어줍니다. dyna bead 세포 준비물을 사전 코팅된 T 75 플라스크에 플레이팅하고, VAs life를 추가하여 플라스크 내 총 부피를 10 mL로 맞춥니다.이제 플라스크를 37 °C, 5% CO₂ 배양기에 넣으십시오. 다음 날 배지를 교체하고, 하루 동안 충분히 배양한 후, 세포 밀도가 70~80% 이상이 될 때까지 이틀마다 배지의 절반을 교체하십시오. 일차 세포 배양물을 추가로 정제하려면 앞서 설명한 대로 항체 접합 dyna beads를 준비하되, 이번에는 CD102 및 muse I chem 2 항체를 사용하십시오.앞서 설명한 대로 T 75 조직 배양 플라스크를 2% gelatin으로 코팅합니다. 이제 세포가 들어 있는 T 75 플라스크를 인큐베이터에서 꺼냅니다. 배지를 흡입 제거하고 8 mL의 PBS로 일차 세포를 세척한 후 흡입 제거합니다.PBS 처리 후, 0.05% trypsin EDTA 2 mL를 첨가하고 세포가 떨어져 나올 때까지 약 5분간 기다립니다. 플라스크를 가볍게 두드려 세포 분리를 돕습니다. trypsin 활성을 억제하기 위해 IM 2 mL를 첨가하고, 남아 있는 부착 세포를 스크레이퍼로 긁어 모읍니다.세포 현탁액을 15 mL 튜브로 옮깁니다. 400 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고, 배지를 흡입하여 제거한 후 세포 펠릿을 2 mL의 0.1% BSA-PBS에 재현탁합니다. 이를 5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브로 옮기고 10 µL의 anti-ICAM-2 dyna beads를 첨가합니다. 실온에서 12분 동안 회전 혼합합니다. 세포 현탁액을 두 개의 1.5 mL 에펜도르프 튜브로 나누어 담고 MPC 시스템에 장착합니다.이전과 동일하게, 0.1% B-S-A-P-B-S-A 1 mL로 비드를 총 5회 세척합니다. 이제 각 튜브를 1 mL의 VAs life에 재현탁하고 세포 수를 측정합니다. 마지막으로, T 75 플라스크당 10 mL의 VAs life에 800에서 1000 K cells의 세포를 분주합니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.배양 세포의 밀도가 약 80% 합쳐질 때까지 이틀마다 배지를 교체합니다. 이렇게 정제된 마우스 폐 내피세포는 실험에 사용할 준비가 된 것입니다. 일반적으로 생후 6~8일 된 새끼 쥐 3마리로부터 준비한 세포를 1주일 동안 배양하면 1.2~1.5 × 10⁶개의 폐 내피세포를 얻을 수 있습니다.예상대로, 이 일차 내피세포들은 광학 현미경 하에서 cobblestone 형태를 보이며 세포 간 접합부에서 VE coherent 염색을 나타냅니다. 이 프로토콜을 사용하면, FACS 분석에서 확인된 바와 같이 대다수의 생쥐 폐 내피세포가 VE coherent 및 VEGF R two를 발현합니다. 빨간색 선은 동형 대조군(isotype specific control)을 나타내며, 녹색 선은 anti VE 또는 anti-VEGF R two 특이적 IgG를 나타냅니다.이 절차를 수행할 때, 표적 조직만을 수확하고 세포의 과다 소화를 방지하며, 비드에 결합된 세포를 충분히 세척하는 것이 중요합니다. 이를 통해 혈관 내피세포를 얻을 수 있습니다. 이 절차는 혈관 생물학 분야의 기능 분석에 활용되어 혈관 신생 및 혈관 투과성과 관련된 반응을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, chem one 항체와 chem two 항체가 결합된 dyna beads를 사용하여 일차 마우스 혈관 내피 세포를 분리하고, 순수한 혈관 내피 세포 배양물을 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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로 불후의 손쥐 뇌 Microvascular 내피 세포 라인의 생성<em&gt; 체외에서</em&gt; 혈액 뇌 장벽 모델

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