노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

설치류 해마 조각은 포유류의 시냅스 기능과 가소성 연구에 자주 사용됩니다. 여기에서 우리는 어린 쥐와 쥐보다 두개골이 더 두껍고 결합 조직이 더 단단한 늙은 쥐와 쥐의 조각을 얻고 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 이러한 특징은 뇌 추출 및/또는 해부를 지연시킬 수 있으며, 결과적으로 시냅스 기능과 가소성의 실제 연령 차이를 무효화하거나 과장할 수 있습니다.

또한, 노화 및 아밀로이드 병리학은 해파리 해부 과정에서 입은 손상을 악화시킬 수 있으며, 이는 생리학적 평가에서 도출된 추론을 더욱 복잡하게 만들 수 있습니다. 이 데모에서는 이러한 문제를 최소화하기 위해 추출 및 해부 절차 중에 취한 조치에 대해 설명합니다. 첫째, 뇌를 빠르게 추출하여 얼음, 차갑고 칼슘이 적은 인공 뇌척수액에 넣습니다.

그런 다음 얼음처럼 차가운 해부 단계에서 하마를 부드럽게 제거하고 비브라토를 사용하여 해마 조각을 준비하고 A CSF를 함유한 산소가 함유된 칼슘에서 배양합니다. 마지막으로, 시냅스 전위와 전류는 여러 해마 하위 영역에서 유발되고 얻어진 결과는 노화 및/또는 알츠하이머병과 같은 병리학이 시냅스 기능 및 가소성에 미치는 영향을 입증하는 것으로 기록됩니다. 이 기술을 적절하게 사용하면 알츠하이머병으로 인한 노화 관련 인지 기능 저하 및 치매에 영향을

이는 시냅스 기능 장애가이 절차를 보여주는 이러한 임상 증상의 가장 초기 바이오 마커 중 하나이기 때문입니다. 오늘은 대형 싱크대 옆 실험실의 PI인 크리스 노리스 박사입니다. 뇌 제거 및 해마 박리를 위해 해부 영역을 준비합니다.

접은 종이 타월, 숫자 11 메스 날, BB 가위, 뼈 urs, 그리고 해마 도구, 정교한 수술 도구의 특수 이중 주걱을 포함하십시오. 또한 작은 수술 용 가위, 얇은 주걱, 플라스틱 peor 피펫, watman 여과지, 얼음으로 채워진 100mm 유리 페트리 접시, 플라스틱 숟가락 및 부분적으로 해동 된 칼슘이 없는 비커를 놓습니다. param으로 덮인 CSF입니다.

쥐의 참수 이후. 뇌는 가능한 한 빨리 추출해야 합니다. 종이 타월 위에 머리를 올려놓고 메스를 사용하여 빠르게 코뼈에서 후두골까지 두피 중앙을 절개합니다.

피부 근육을 완전히 절개하여 두개골 봉합사를 완전히 노출시켜야 합니다. 머리를 단단히 잡고 정중선 봉합사를 따라 후두판, 두정엽 및 전두판을 절단합니다. 아래쪽 가위는 두개골의 내부 표면에 단단히 고정하고 뇌에서 멀리 떨어뜨려 놓으십시오.

이는 부주의한 가우징을 방지하는 데 중요합니다. 다음 슬라이드. Ron 배심원은 왼쪽 두정판(parietal plate) 아래에 놓고 턱을 함께 쥐어짜고 위아래로 굴려 두정판과 후두판을 당겨냅니다.

필요한 경우 Ron 배심원을 사용하여 왼쪽 정면 플레이트도 제거합니다. 다른 반구에 대해 반복합니다. 판이 옮겨지면 Ron 배심원이나 가위를 사용하여 측두판에 부착되어 뇌 표면을 가로질러 늘어날 수 있는 경막을 부드럽게 잡아당기거나 자릅니다.

이제 론 배심원을 뇌와 오른쪽 측두판 사이로 밀어 넣어 두개골 쪽으로 압력을 유지하고 뇌에서 멀어지게 합니다. 바삭 바삭 소리가 들리거나 느껴질 때까지 시간판을 짜고 비틀십시오. 왼쪽에도 반복합니다.

해마 도구 앞의 넓은 주걱을 뇌의 복부 표면과 아래쪽 두개골 판 사이에 완전히 뇌 아래에 올 때까지 밀어 넣습니다. 해마 도구를 사용하여 온전한 뇌 신경을 절단하기 위해 좌우로, 앞뒤로 몇 번 옆으로 움직입니다. 뇌를 퍼서 칼슘이 없는 CSF 커버에 퍼핀을 바르고 약 1분 동안 식히십시오.

하마를 추출하려면 숟가락을 사용하여 A CSF에서 뇌를 추출하고 얼음처럼 차가운 페트리 접시 뚜껑에 있는 CSF에 적신 와트만 종이에 놓습니다. 메스 날을 사용하여 소뇌와 상부 전두엽의 약 1/4을 제거합니다. 이제 반구 내부 균열을 잘라 두 반구를 완전히 분리합니다.

한쪽 반구를 A CSF 슬러시에 다시 넣고 다른 반구를 해부 단계에 세워 전두엽의 관상평면이 흰색 뇌간을 향하도록 하고 중뇌가 분홍색 또는 회색을 띤 피질과 쉽게 구별되어야 합니다. 중뇌에서 캘리를 찾습니다. 이것들은 두 개의 흰색 손잡이처럼 보이며 뇌의 맨 위에 있을 것입니다.

이 방향에서 가위로 중뇌를 부드럽게 잡고 주걱을 캘리와 피질 사이로 밀어 넣습니다. 그런 다음 뇌간, 중뇌 및 시상을 부드럽게 당겨 빼냅니다. 결합 조직이나 혈관 구조는 가위로 잘라야 할 수도 있습니다.

주걱의 날카로운 모서리를 사용하여 fornix를 절단하십시오. 해마의 앞쪽 등쪽 부분에 위치한 흰색 섬유 다발. 가위로 뇌간, 중뇌, 시상을 뇌의 나머지 부분에서 완전히 분리하지 않고 부드럽게 계속 잡아당깁니다.

해마의 바닥에서 얕은 쌍곡선을 형성하는 섬유의 흰색 파이는 이제 이 방향에서 볼 수 있어야 합니다. 전달 피펫을 사용하여 FIA 아래의 틈새로 A CSF를 부드럽게 분출하여 해마와 피질을 분리하는 데 도움을 줍니다. 주걱을 이 틈으로 부드럽게 밀어 넣고 가위로 뇌간, 중뇌 및 시상을 단단히 잡은 상태에서 해마를 굴려 해마에서 남아 있는 피질, 혈관 및 백질을 부드럽게 잘라냅니다.

CSF 몇 밀리리터를 사용한 Dous. 전사 피펫을 사용하여 CSF 슬러시로 조직을 적시고 차갑게 유지합니다. 다음으로, 다른 반구를 제거하고 해부를 반복하여 쥐 하마 캄피를 절편화합니다.

비브라토의 저장소를 얼음처럼 차갑고 칼슘이 없는 A CSF로 채우십시오.tage와 블레이드가 완전히 잠기도록 합니다. 메스를 사용하여 각 해마의 상부 및 코들 끝을 잘라내고 각 해마의 치상회가 서로 마주보도록 하여 상부 표면에 함께 세웁니다. 뇌 조직을 장착 블록에 붙이고 비브라토의 절편 단계로 옮깁니다.

시냅스 생리학 실험의 경우 400마이크로미터 절편이 권장됩니다. 넓은 입 전사 피펫을 사용하여 슬라이스를 얼음처럼 차가운 칼슘이 없는 작은 페트리 접시에 옮깁니다. CSF입니다.

슬라이싱이 완료되면 슬라이스는 A CSF를 함유한 산소화된 칼슘으로 채워진 보관 챔버로 옮겨집니다. 챔버를 섭씨 27도에서 32도까지 서서히 가져와 기본적인 세포 외 기록을 수행합니다. 급성 절편에서 기록 챔버는 현미경 스테이지에 배치되어 전쟁 전 A CSF가 유량 조절기를 통해 중력으로 공급되고 중앙 진공 라인에 의해 제거됩니다.

작은 페인트 브러시를 사용하여 슬라이스를 기록실로 옮겨 A CSF에 담그고 삽입된 그물 위에 놓이도록 합니다. 슬라이스가 10-15분 동안 적응하도록 합니다. 슬라이스가 적응하는 동안 자극기 또는 자극 아이솔레이터를 켜고 출력을 0으로 낮춥니다.

그런 다음 ca 3 경계 근처의 ca 2의 방사선 층 원자 영역의 슬라이스 위에 자극 전극을 놓습니다. 기록 전극을 ca 1층 방사선 원자로 낮추어 슬라이스의 표면을 파괴합니다. 여기에서 자극기의 출력을 적당한 수준까지 돌립니다.

자극 아이솔레이터는 약 150마이크로암페어로 설정됩니다. 자극 아티팩트가 기록될 때까지 자극 전극을 작은 간격으로 천천히 내립니다. ca one에서는 CA 1 반응을 획득하면서 자극 전극과 기록 전극을 모두 주기적으로 천천히 내립니다.

클램프 X와 같은 소프트웨어 획득 프로그램을 사용하여 섬유 발리와 흥분성 시냅스후 전위 진폭이 최대 수준에 도달할 때까지 시냅스 강도 곡선을 설정합니다. 그런 다음 소프트웨어를 사용하여 다양한 강도로 자극을 전달하고 해당 활동을 1차 기록하십시오. 사용되는 자극 강도 수준의 범위와 수는 FV 또는 EPSP 값에 대해 표시할 때 시그모이드 곡선을 생성하기에 충분해야 합니다.

다음으로 시냅스 가소성을 조사하기 위해 각 슬라이스에 대한 자극 강도를 재설정하여 1밀리볼트 반응이 유도되도록 합니다. 0.033헤르츠 EPSP의 주파수에서 베이스라인 자극을 시작합니다. 기울기 값은 장기 강화 LTP 또는 장기 우울증 LTD를 유도하기 전에 최소 20분 동안 안정적이어야 합니다.

기준선 기간을 기록하려면 클램프 X 매개변수 파일을 사용하여 30초마다 자극하고 기록합니다. LTP를 유도하기 위해 LTD 유도를 위해 200밀리초마다 주어지는 100헤르츠 자극의 1초 트레인 또는 200헤르츠 자극의 여러 짧은 버스트를 사용하여 LTP를 유도하는 별도의 매개변수 파일을 엽니다. 1헤르츠의 속도로 900개의 자극 펄스를 전달합니다.

자극 후 트레인은 기준선 매개변수 파일로 다시 전환하고 60분 이상 동안 시냅스 반응을 수집합니다. 고저주파 자극 전과 후 60분 후에 얻은 EPSP 기울기 값을 비교하여 시냅스 강도의 증가로 표시되는 LTP 또는 시냅스 강도의 감소로 표시되는 LTD의 존재를 확인합니다. 두 과정 모두 학습과 기억에 대한 중요한 메커니즘을 반영하는 것으로 널리 알려져 있습니다.

여기서, 두 개의 A PP PS에서 두 개의 서로 다른 해마 절편에서 대표적인 시냅스 강도 곡선을 보여줍니다. 한 마리의 마우스가 표시되어 있습니다. 한 마리의 마우스는 새로운 항염증성 아데노 관련 바이러스 시약으로 치료를 받았습니다. 다른 한 명은 통제된 바이러스 시약으로 치료했습니다.

유사한 수의 시냅스전 섬유가 치료 조건에 걸쳐 활성화될 때 볼 수 있듯이. 그룹이 x축에 표시된 것과 같이 유사한 FV 진폭을 나타내면 시약 슬라이스 곡선이 왼쪽으로 이동하여 더 큰 EPSP 진폭을 나타냅니다. 이러한 데이터는 표시된 처리된 슬라이스의 시약에서 기저 시냅스 강도가 더 크다는 것을 보여줍니다.

다음은 동일한 슬라이스에 대해 수행된 LTP 실험의 결과입니다. 시약 슬라이스의 EPSP 기울기 값은 100Hz 자극 전달 후 1시간 기준선 동안 대조군 슬라이스에 비해 훨씬 크며, 이는 LTP가 시약 슬라이스에 존재했지만 대조군 슬라이스에는 존재하지 않았음을 나타냅니다. 이 그림은 100헤르츠 자극 전달 전과 60분 후의 시약 A 및 대조군 마우스 슬라이스에서 EPSP 파형이 어떻게 보이는지 보여줍니다.

100 헤르츠 이후 기간에서 EPSP 기울기의 증가는 시약에서 매우 분명하며, 이는 LTP를 함께 나타내는 슬라이스입니다. 지금까지 보여진 그림의 실험은 시약 A가 시냅스 강도를 증가시키고 LTP 결핍을 개선한다는 것을 나타냅니다. PP PS에서 한 마우스에서 노화된 쥐의 해마 LACS에 대해 유사한 실험을 수행했습니다.

여기에서는 새로운 항염증제를 투여한 쥐와 대조군 비히클 시약으로 투여한 다른 쥐의 두 가지 다른 해마 절편의 시냅스 강도 곡선을 보여줍니다. 이러한 곡선은 두 슬라이스에 대해 매우 유사하며, 이는 약물 A가 기저 시냅스 강도에 거의 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 이 그림은 동일한 슬라이스에 대해 수행된 LTD 실험의 결과를 보여줍니다.

노화된 쥐의 경우 일반적으로 처리된 절편을 치료한 차량의 EPSP 기울기 값은 하나의 자극을 전달한 후 1시간 기준선에서 저하됩니다. 그러나 약물 A 슬라이스의 EPSP 기울기 값은 우울증이 거의 또는 전혀 없음을 나타내며, 여기에 표시된 LTD의 부재는 1 헤르츠 자극 전달 전과 60분 후 약물 A 및 차량 랫드 슬라이스의 EPSP 파형입니다. 포스트 1 헤르츠 기간에서 EPSP 기울기의 감소는 차량 슬라이스에서 매우 분명하지만 약물 슬라이스에서는 그렇지 않습니다.

이 그림의 결과는 약물 a가 LTD 유도를 차단하는 노화된 쥐의 가소성 차이를 개선하지만 기저 시냅스 기능에는 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줍니다. 이러한 데이터는 노화된 쥐와 알츠하이머 모델 마우스에서 시냅스 기능 및 가소성의 여러 매개변수가 실험적 치료에 의해 조절될 수 있음을 보여주며, 실험용 신약 및 시약의 누트로픽 및/또는 신경 보호 잠재력을 조사하기 위한 급성 해마 절편의 유용성을 강조합니다. 이 절차를 시도하는 동안 속도와 뇌를 추출하는 것의 균형을 정확하고 부드러움으로 기억하고 전기 생리학적 측정을 위해 해마를 해부, 절단 및 처리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.