JoVE 실험 백과사전
신경과학
0 조회수 • 1:30 분 • March 4th, 2025
신경퇴행성 질환의 바이오마커인 인산화알파-시누클레인(phosphorylated alpha-synuclein)을 포함한 CSF 단백질로 시작하십시오.
세제, 환원제 및 추적 염료가 포함된 로딩 버퍼를 추가합니다.
단백질을 변성시키기 위하여 가열하고, 그 후에 SDS-PAGE 젤로 그(것)들을 적재하십시오.
전기영동을 수행하여 분자량에 따라 단백질을 별개의 띠로 분리합니다.
교반과 함께 블로팅 버퍼에서 겔을 배양합니다.
그런 다음, 겔에서 멤브레인으로 단백질 밴드를 전기 전사합니다.
멤브레인에 단백질을 유지하기 위해 고정제로 멤브레인을 처리한 다음 세척하십시오.
알파-시누클레인의 인산화를 유지하기 위해 일차 항체와 인산가수분해효소 억제제를 함유한 차단 용액으로 배양합니다.
항체는 인산화된 알파-시누클레인과 독점적으로 상호 작용하며, 차단 시약은 비특이적 상호 작용 부위를 차단한 다음 세척합니다.
1차 항체와 상호 작용하는 효소 접합 2차 항체를 도입한 다음 세척합니다.
화학발광 기질을 추가하여 효소와 상호 작용하고 화학발광을 생성합니다.
화학발광 밴드는 인산화된 알파-시누클레인의 존재를 확인합니다.