배아 마우스 모델에서 자궁 내 나노주입을 통한 신경판 세포 조작

신경

형성 전 배아를 포함하는 노출된 자궁으로 마취된 임신한 마우스를 확보합니다. 이 단계에서 신경판은 열려 있고 양수에 직접 노출됩니다.

선택한 배아를 탄성 멤브레인이 있는 페트리 접시에 놓아 안정화시킵니다. 배아를 고정하고 수분 공급을 위해 식염수를 바르십시오.

초음파 프로브를 배아 위에 정렬하고 양강 직경을 측정하여 최적의 주입량을 계산합니다.

고역가 렌티바이러스 용액이 들어 있는 나노 주사 바늘을 표적 배아 위에 거의 수직 각도로 배치합니다.

양막강에 정확한 소량을 주입하고 바늘을 부드럽게 집어넣고 초음파 탐침을 제거합니다.

배아를 마우스 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다.

주입된 렌티바이러스는 신경판 세포와 융합하여 유전 물질을 방출하고, 이는 DNA로 역전사되어 숙주 게놈에 통합됩니다.

이를 통해 신경판 세포에서 안정적인 유전자 조작이 가능해 잠재적인 치료 응용을 지원

할 수 있습니다.

집게를 사용하여 배아 사이의 조직을 잡고 복부에서 양쪽 자궁 뿔을 조심스럽게 빼냅니다. 난소에서 자궁경부까지 또는 자궁경부에서 난소까지 양쪽의 배아를 세고 번호를 매깁니다.

그런 다음 젖은 면봉으로 주입할 처음 세 개를 제외한 모든 배아를 복강으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 그런 다음 시중에서 판매되는 변형 페트리 접시의 둥근 중앙 개구부에 접착된 탄성 멤브레인에 PBS 한 방울을 놓고 배아 바로 위에 놓습니다. 닫힌 집게를 고무줄의 절개 부위에 삽입한 다음 집게를 풀어 탄성 절개 부위를 열고 액체를 배아에 떨어뜨립니다.

집게를 사용하여 고무줄을 통해 세 개의 배아에 해당하는 자궁 부분을 당기고 페트리 접시를 마우스의 복부에 부드럽게 놓습니다. 4개의 점토 발을 사용하여 복부 위의 페트리 접시를 고정하고 고정하여 마우스에 가해지는 압력을 줄이고 마우스의 호흡과 심장 박동에 대한 이미징 민감도를 줄입니다. 다음으로, 집게와 젖은 면봉을 사용하여 자궁과 고무줄을 조정하여 고무줄이 마우스 피부 주위에 밀봉되도록 하여 PBS 누출을 방지합니다.

다음으로, 자궁을 고정하려면 모델링 점토 실린더를 배아 또는 자궁의 오른쪽으로 누르고 배아와 자궁이 PBS로 완전히 덮일 때까지 페트리 접시에 PBS를 추가합니다. 주사 기록을 용이하게 하려면 초음파 프로브를 PBS에 담그고 첫 번째 배아가 초음파 프로브와 정렬되도록 마우스 또는 수술대를 조정합니다. 세 배아를 모두 스캔하고 양강을 검사합니다.

그런 다음 초음파 기계를 사용하여 양막의 직경을 측정하여 적절한 주입량을 결정합니다. 주입 컨트롤러를 사용하여 결정된 주입량과 주입 속도를 초당 23나노리터의 주입 속도로 느리게 설정합니다. 바늘을 PBS로 내린 후 레일 시스템의 메인 휠을 사용하여 액체가 바늘 끝에 도달할 때까지 나노인젝터 컨트롤러에서 비우기를 누릅니다.

그런 다음 PBS에서 바늘을 들어 올리고 주입을 눌러 대략적인 원하는 부피의 한 방울이 배출되는지 확인합니다. 바늘을 PBS로 다시 내리고 마이크로 매니퓰레이터의 Y-평면 휠로 나노 인젝터를 움직여 바늘을 초음파 프로브 및 배아에 맞춥니다. 주입 각도 휠로 바늘 각도를 조정하여 자궁벽에 대해 거의 수직에 가까운 주사 각도를 보장합니다.

그런 다음 마이크로 매니퓰레이터의 주입 휠을 사용하여 한 번에 바늘을 양수강에 삽입합니다. 초음파 이미지에서 바늘 끝이 사라지면 프로브를 앞뒤로 움직여 바늘의 초점을 다시 맞춥니다. 그런 다음 Inject를 적절한 횟수 눌러 원하는 볼륨을 주입합니다.

필요한 양을 주입한 후 5-10초 동안 기다렸다가 한 번의 부드러운 움직임으로 바늘을 집어넣습니다.

그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 초음파 프로브와 바늘을 PBS에서 들어 올리고 손상과 부상을 방지하기 위해 바늘을 작업자에게서 멀리 돌립니다.

집게를 사용하여 첫 번째와 두 번째 배아를 고무줄을 통해 부드럽게 밀어 복부에 다시 넣습니다.

최적의 양강을 가진 모든 배아를 주입한 후, 배아와 자궁을 마우스의 복부로 부드럽게 밀어 넣습니다.