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신경과학
0 조회수 • 2:50 분 • August 29th, 2025
열 블록에 냉동 보호제와 함께 보관된 신경 전구 세포 또는 NPC를 해동합니다.
이 NPC는 파킨슨병의 핵심 요인인 증가된 알파-시누클레인을 발현합니다.
해동된 세포를 따뜻한 기초 배지가 들어 있는 튜브로 옮겨 냉동 보호제를 희석합니다.
원심분리하여 세포를 펠릿화하고 상청액을 제거한 다음 펠릿을 신경 매질에 재현탁합니다.
세포 현탁액을 ECM으로 코팅된 멀티웰 플레이트에 추가하고 배양하여 세포 접착 및 증식을 허용합니다.
가이드 RNA, 비활성화된 Cas9-DNA 메틸트랜스퍼라제 및 항생제 내성 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 추가합니다.
바이러스 진입, 바이러스 RNA의 역전사, 숙주 게놈으로의 통합 및 이식 유전자 발현을 용이하게 배양합니다.
가이드 RNA는 dCas9를 알파-시누클레인 유전자로 지시하며, 여기서 메틸트랜스퍼라제 매개 DNA 메틸화는 알파-시누클레인 발현을 감소시킵니다.
배지를 항생제 함유 신경 배지로 교체하여 형질도입된 세포를 선택하고 형질도입되지 않은 세포는 세포사멸을 겪습니다.
MD NPC가 포함된 Cryovial을 섭씨 37도의 열 블록에 2분 동안 넣고 해동된 세포를 10밀리리터의 따뜻한 DMEM-F12가 있는 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
300g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 미리 데운 완전 N2B2 배지 2밀리리터에 세포를 다시 현탁합니다. 세포 현탁액에 N2B27 2밀리리터를 첨가하고 이전에 준비된 BMM 코팅 6웰 플레이트의 각 웰에 2밀리리터의 세포를 도금합니다.
세포를 섭씨 37도에서 5% CO_2와 함께 밤새 배양합니다. MD NPC가 70% 합류에 있을 때 2마이크로리터의 렌티바이러스 가이드 RNA d-Cas9-DNMT3A 벡터를 추가하여 형질도입하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이칩니다. 이전과 동일한 조건에서 세포를 16시간 동안 배양한 후 형질도입 48시간 후에 N2B27 배지를 교체합니다.
퓨로마이신 밀리리터당 5마이크로그램과 함께 N2B27을 첨가합니다.