전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

본 절차의 전반적인 목적은 탈세포화된 간 매트릭스를 사용하여 탈세포화된 간 이식편을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 공여자 간에 캐뉼라를 삽입함으로써 수행됩니다. 그 후, 일련의 세제 용액을 관류하여 해당 장기를 탈세포화합니다.

그 다음, 관류를 통해 성인 일차 간세포를 주입함으로써 탈세포화된 간 매트릭스의 혈관 재형성을 수행합니다. 마지막으로, 세포화된 간 이식편을 배양하기 위해 인 비트로(in vitro) 관류 시스템을 사용합니다. 궁극적으로, 관류 배지 내의 알부민, 요소 및 총 담즙산 분비량을 측정함으로써 크기가 조정된 이식편의 인 비트로(in vitro) 간 기능을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

합성 생체 재료를 이용한 스캐폴드 제작이나 전통적인 조직 공학 기법과 같은 기존 방식에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은, 본인의 의견으로는 조직 특이적인 세포외 기질 조성이 존재한다는 점입니다. 관류 탈세포화 스캐폴드는 혈관 구조와 같은 조직 특이적 미세 구조 또한 유지하고 있습니다. 이러한 혈관 구조의 존재 덕분에 세포를 스캐폴드 내에 더욱 균일하게 재도입할 수 있습니다.

또한 이를 통해 영양분을 균일하게 관류하여 세포 생존율을 높일 수 있습니다. 프로토콜의 감속 단계는 저희 실험실의 박사후 연구원인 Nima가 시연할 예정입니다. 재활성화 단계는 역시 박사후 연구원인 Gabriel Price가 시연하겠습니다.

그녀의 연구는 이러한 이식편의 산업화에 초점을 맞추고 있습니다. 관류 탈세포화를 수행하기 위해, 먼저 간문맥 캐뉼라 삽입을 통해 쥐의 간을 적출합니다. 18게이지 카테터를 사용하고, 하대정맥과 상대정맥은 열어둡니다. 장기는 10 centimeter 페트리 접시 내의 인산염 완충 식염수(PBS)에 담가 수분을 유지하십시오.

다음으로 8L 저장조, 연동 펌프 및 버블 트랩으로 구성된 관류 시스템을 구축합니다. 관류 시스템을 인산염 완충 식염수(PBS)로 채우고 10분 동안 가동합니다. 그런 다음 10cm 페트리 접시에 PBS를 채우고 완충액의 유속을 1.2 mL/min으로 낮춥니다.

채취한 간을 PBS가 담긴 페트리 접시에 조심스럽게 옮기고 하룻밤 동안 관류시킵니다. 다음 날, 증류수에 희석한 0.01% sodium ESAL sulfate 또는 SDS를 사용하여 간을 5분 동안 관류합니다.

그 후 PBS로 교체하여 1시간 동안 유지합니다. SDS 및 PBS 관류 단계를 3회 더 반복하며, SDS 관류 시간을 10분, 15분, 그리고 마지막에는 20분으로 늘립니다. 그런 다음 0.01% SDS를 사용하여 24시간 동안 간을 관류합니다.

0.1% SDS로 24시간 동안 처리합니다. 0.2% SDS로 3시간 동안, 0.5% SDS로 3시간 동안 처리합니다. 증류수로 15분 동안 세척하고, 결합된 핵산을 제거하기 위해 증류수에 희석한 1% Triton X 100으로 30분 동안 처리합니다.

마지막으로, 관류가 완료된 후 필요에 따라 PBS로 2시간 동안 세척하여 탈세포화된 간 매트릭스(DLM)를 씻어내고, 중앙엽을 제외한 모든 엽을 절제합니다. 사용 전까지 DLM을 깨끗하게 밀봉된 Petri dish에 담아 PBS와 함께 4°C에서 보관합니다. DLM을 멸균하려면 0.1% per acetic acid와 4% ethanol이 포함된 멸균 PBS로 세척한 후 4°C에서 3시간 동안 배양합니다.

다음으로, DLM을 멸균된 PBS로 2회 세척합니다. 그 후 2% penicillin streptomycin(10 µg/mL), gentamycin 및 2.5 µg/mL Amphotericin B가 포함된 PBS로 세척합니다. 탈세포화된 간은 재세포화 실험에 사용하기 전까지 동일한 용액에 넣어 4 °C에서 보관합니다.

둘째, 조직 배양 후드 내에서 탈세포화된 간 매트릭스를 세포화합니다. 간을 탈세포화할 때 사용했던 것과 유사한 관류 시스템을 준비하십시오. 관류 시스템에 high glucose DMEM, 10% fetal bovine serum, 100 units/mL penicillin 및 100 µg/mL streptomycin이 포함된 배양액 200 milliliters를 채웁니다.

DLM을 관류 챔버에 넣고 펌프를 5 mL/min 속도로 가동하면서 간문맥 캐뉼라를 통해 관류 시스템에 연결합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 30분 동안 배지로 DLM을 관류합니다. 그다음, 관류 시스템의 흐름을 멈추고 성체 쥐에서 분리한 간세포 5,000만 개를 버블 트랩을 통해 관류 시스템으로 천천히 주입합니다.

흐름을 분당 10 milliliters로 다시 시작하고 배지를 10분 동안 재순환시킵니다. 배지의 흐름을 다시 중단합니다. 5,000만 개의 간세포를 추가로 주입합니다.

그런 다음 흐름을 분당 10 milliliters로 다시 시작합니다. 총 200 million 개의 간세포가 DLM에 투입될 때까지 이 절차를 반복합니다. 모든 세포가 DLM에 주입되면, 유출액을 50 milliliter 원심분리 튜브에 수집하고 800 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.

상층액을 제거하고 펠릿을 하나의 튜브에 모읍니다. 트라이판 블루 배제법(trypan blue exclusion)을 통해 세포 수와 생존율을 측정합니다. 이는 배양을 위한 파종 효율을 설정하기 위함입니다.

세포화된 간 이식편. 산소 공급기를 포함하는 멸균 관류 시스템을 구축합니다. 관류 시스템을 5% PBS와 0.5 units/mL의 인슐린이 포함된 Williams E와 같은 배양액 50 milliliters로 채웁니다.

EGF 20 ng/mL, 글루카곤 14 ng/mL, 히드로코르티손 7.5 µg/mL, 페니실린 100 units/mL 및 스트렙토마이신 100 µg/mL를 준비합니다. 펌프를 5 mL/min으로 작동시키면서, 세포화된 간 이식편을 관류 챔버에 넣고 문맥 캐뉼라를 통해 관류 시스템에 연결합니다.

기포 형성을 방지하기 위해, 무균 상태에서 관류 챔버를 닫고 배양 중 누출이 발생하지 않도록 단단히 밀봉합니다. 관류 시스템을 37 °C, 10% carbon dioxide 조건에서 배양하고 관류 유속을 15 mL/min으로 높입니다. 산소 공급기를 95% oxygen 및 5% carbon dioxide 혼합 가스 탱크에 연결하고, 가스 유속을 0.5 L/min으로 설정합니다.

이를 통해 산소 분압을 약 400 mmHg로 유지해야 합니다. 배지를 매일 교체하며 최대 10일 동안 배양을 계속합니다. 배양 기간 종료 시 이식편의 간 기능을 모니터링하기 위해 매일 배지를 채취하여 알부민, 요소 및 총 담즙산 분비량을 측정합니다.

분자 및 조직학적 분석을 위해 세포 제거된 간 이식편을 샘플링합니다. 쥐 간의 완전한 탈세포화에는 설명된 프로토콜을 사용하여 약 72시간이 소요됩니다.

결과물인 매트릭스는 천연 간의 섬유성 콜라겐 100%, 글리코아미노글리칸 50%, 그리고 DNA의 5%만을 유지합니다. 매트릭스의 혈관 구조는 부식 주조법과 주사 전자 현미경 분석을 통해 확인된 바와 같이 보존됩니다. DLM 내 혈관 미세구조의 존재는 96%의 효율로 세포를 재정착시키고 이후 관류하는 것을 용이하게 합니다.

in vitro 배양의 경우, 재세포화된 간 이식편은 최대 10일 동안 in vitro 배양될 수 있으며, 알부민, 요소 및 총 담즙산 분비를 통해 확인된 적절한 간 기능을 나타냅니다. 따라서 이 영상을 시청하신 후에는 전체 간을 탈세포화하고 재세포화하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.