Name: 전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 배우세요 전체 간의 perfusion decellularization 및 hepatocyte 재세포화 기술을 통해 기능성 간 이식편을 제조하는 방법을. 이 기법은 세포외기질과 미세구조를 보존하여 재생의학 및 장기공학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 체외 재관류 챔버의 설계 잭 Milwid 감사하고 싶습니다. 이 작품은 KU, 미국 NSF KU 및 BEU 어린이를위한 이너스 병원 CBET - 0853569을​​ 내, R00DK080942에 미국 NIH, R01DK59766 및 R01DK084053에서 부여 (부여 안돼. 8503)에 의해 지원되었다. 우리는 또한 지원과 어린이를위한 이너스 병원 인정합니다.

1. 간 Decellularization <ol><li> 포털 정맥 사용 cannulation 및 18 게이지 카테터와 쥐의 간을 수확. 열등하고 우수한 베나 카바를 열어 둡니다. 인산염의 기관은 수산화 유지 10 cm 배양 접시에있는 호수 (PBS)가 버퍼. </li><li> 8 리터 저수지, 연동 펌프와 버블 트랩으로 구성되어 있습니다 재관류 시스템을 설정합니다. </li><li> 인산염과 재관류 시스템을 작성하는 것은 생리 버퍼링하고 10 분 동안 계속 실행. 10 cm 배양 접시에 PBS를 입력하고 인산의 흐름 속도는 1 ML / 분에 생리 버퍼 줄일 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 인산염에 수확 간 전송하면 생리 채워진 10 cm 배양 접시를 버퍼. </li><li> 하룻밤 PBS의 재관류를 계속합니다. </li><li> 5 분 증류수에 0.01 % (W / V) 나트륨 dodecyl 황산 (SDS)와 재관류를 시작합니다. </li><li> 1 시간 PBS로 Perfuse. </li><li> 매번 10, 15 및 20 분 SDS 재관류 시간을 증가 단계 1.6 및 1.7 이상을 세 번 반복합니다. </li><li> 24 시간 동안 0.01 % (W / V) SDS와 재관류를 계속합니다. </li><li> 24 시간 동안 0.1 % (W / V) SDS와 재관류를 계속합니다. </li><li> 3 시간 동안 0.2 % (W / V) SDS와 Perfuse. </li><li> 3 시간 동안 0.5 % (W / V) SDS와 Perfuse. </li><li> 15 분 동안 증류수로 Perfuse. </li><li> 어떤 바운드 핵산을 제거하는 데 30 분의 1 % (W / V) 증류수의 트리톤 X - 100 Perfuse. </li><li> decellularized 간 매트릭스 (DLM), 2 시간 동안 PBS로 perfuse을 씻어. </li><li> 옵션 : 중간 엽을 제외한 모든 엽 (叶)을 잘라 내다. </li><li> (그림 1)를 사용하여 준비까지 4 O C에서 PBS에 담가 깨끗하고 봉인 페트리 접시에서 DLM을 저장합니다. </li><li> DLM를 검사하려면 : 1) 멸균 PBS 4 O C.에서 0.1 % (V / V) peracetic 산성과 4 % (V / V) 3 시간 동안 에탄올과 부화를 포함하는으로 DLM을 플러쉬 2) 멸균 PBS로 2 번 씻으십시오. 3) 멸균 PBS가 2% 페니실린 - 스트렙토 마이신, 10ug / ML gentamicin, 및 2.5 UG / ML amphotericin B. 스토어 recellularization 실험에 사용할 준비까지 4 O C에서 동일한 솔루션에 decellularized 간을 포함로 씻으십시오. </li></ol> 2. Decellularized 간 매트릭스 Recellularization <ol><li> 재관류 챔버, 무균 조건 하에서 연동 펌프와 버블 트랩으로 구성되어 있습니다 재관류 시스템을 설정합니다. 문화 매체, 예를 들어, 높은 혈당 DMEM (시그마) 10 % 태아 소 혈청 (Hyclone), 100 U ML -1 페니실린, 100 μg ML -1 스트렙토 마이신 (Invitrogen) 200 ML과 재관류 시스템을 채우십시오. </li><li> 재관류 챔버에서 decellularized 간 매트릭스를 놓고 펌프 어떤 공기 거품의 형성을 피하기 5 ML / 분 실행되는 동안 포털 정맥 정맥을 통해 관류 시스템에 DLM를 연결합니다. </li><li> 30 분 DLM을 통해 매체의 재관류를 허용합니다. </li><li> 적어도 90 % 생존과 성인 쥐의 기본 hepatocytes을 분리. </li><li> 재관류 시스템의 흐름을 중지하고 천천히 거품 트랩을 통해 관류 시스템에 50,000,000 hepatocytes를 (문화 매체 1-3 ML)을 주입. </li><li> 10 ML / 분 흐름을 시작하고 10 분 동안 매체를 recirculate. </li><li> 200000000 세포의 총이 DLM (그림 2) 6에 도입되기 전까지 단계 2.5 2.6 반복합니다. </li><li> 일단 모든 세포가 DLM에 perfused 있으며, 10 분 동안 600 RPM에서 4 50 ML 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 perfusate를 수집합니다. supernatants를 버리고 하나의 튜브로 알약을 수집합니다. 시딩 효율을 결정하는 trypan 파랑 배제를 통해 세포 생존의 수를 결정합니다. </li></ol> 3. Recellularized 간 이식의 체외 문화 <ol><li> 재관류 챔버, 멸균 조건 (그림 3)에 따라 연동 펌프, oxygenator 및 버블 트랩으로 구성되어 있습니다 재관류 시스템을 설정합니다. 문화 매체 50 ML과 재관류 시스템을 채우기 예, 윌리엄스 'E (시그마) 5 % 태아 소 혈청 (Hyclone가), 0.5 U ML -1 인슐린 (엘리 릴리), 20 NG ML -1 EGF (Invitrogen) 14 NG ML -1 글루카곤 (베드퍼드 연구소), 7.5 μg ML -1 하이드로코티손 (Pharmacia), 100 U ML -1 페니실린, 100 μg ML -1 스트렙토 마이신 (Invitrogen). </li><li> 재관류 챔버에서 recellularized 간 이식을 놓고 펌프 어떤 공기 거품의 형성을 피하기 5 ML / 분 실행되는 동안 포털 정맥 정맥을 통해 관류 시스템에 DLM를 연결합니다. </li><li> 무균 재관류 챔버를 닫고 문화 동안 누출을 방지하기 위해 단단히 밀봉합니다. </li><li> 37 O C이며 10 %의 CO가 인큐베이터에 재관류 시스템을 전송 2 15 ML / 분에 재관류 흐름 속도를 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 95 % O 2 5% CO 2 가스 혼합물 탱크에 oxygenator를 연결하고 가스 유량 0.5 리터 / 분으로 설정합니다. 이것은 approxima의 산소 분압을 달성한다tely 400 mmHg. </li><li> 문화 문화 매체의 매일 변화에 최대 10 일 계속 사용할 수 있습니다. 문화 매체는 알부민, 요소 및 총 담즙산의 분비 등 그래프트의 간 기능의 모니터링을 위해 매일 맛볼 수 있습니다. 문화 기간의 끝에, recellularized 간 이식은 분자와 histological 분석을 위해 샘플 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 쥐 간 전체 decellularization는 설명 프로토콜을 사용하는 방법에 대한 72 시간 정도 소요됩니다. 결과 매트릭스는 원섬유의의 콜라겐의 100 %, glycosaminoglycans의 50 %와 원시 간 DNA (표 1) 6 단 5 %를 유지합니다. 모체의 혈관 구조로 부식은 주조 및 전자 현미경 분석 (그림 4) 6을 검색하여 입증 보존되어 있습니다. DLM 내에서 혈관 마이크로 아키텍처의 존재는 96 % 효율성과 체외 문화에 대한 이후의 재관류와 세포와의 repopulation을 용이하게합니다. recellularized 간 이식은 체외에서 10 일까지 교양과 같은 알부민, 요소 및 총 담즙산의 분비 (그림 5) 6를 통해 확인 적절한 간 기능을 표시 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. decellularization 과정의 끝에 간 매트릭스를 Decellularized. 절제술 후 (A) 전체 간은 (B) 평균 엽. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. DLM의 recellularization의 도식 표현. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. recellularized 간 이식의 체외 문화에 대한 재관류 시스템 설정. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. microvascular 구조는 decellularized 간 매트릭스에 유지됩니다. A) 정상 간 B) decellularized 간, 포털 (적색)과 정맥 (파란색) vasculature의 부식 캐스트 이미지. DLM C의 전자 현미경 이미지) 선박, D) 담즙 덕트와 같은 소형 선박 (화살표), 스케일 바 (A, B) 5mm (C, D) 20 μm의를 특징으로 섹션을 검사합니다. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 체외 재관류 문화에있는 동안 recellularized 간 이식의 간 특정 기능을 수행합니다. A) 알부민 분비 (P = 0.5249가), B) 우레아 생산 (P = 0.5271가)와 C) 총 담즙산의 분비 (P = 0.0114가). 실험과 통제 사이의 차이의 통계 분석은 = 0.01에서 프리드먼의 시험에 의해 10 D 문화에 걸쳐 이루어졌다. 오차 막대는 SEM (N = 3)을 나타냅니다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 신선한 livera </td><td> Decellularized 간 매트릭스 </td><td rowspan="2"> P - 값 </td><td rowspan="2"> 신선한 간 비율 (%) </td></tr><tr><td></td><td> N = 4 </td><td> N = 8 </td></tr><tr><td> 콜라겐 </td><td rowspan="2"> 0.07 ± 0.01 </td><td rowspan="2"> 0.08 ± 0.03 </td><td rowspan="2"> 0.56 </td><td rowspan="2"> 1백14퍼센트 </td></tr><tr><td> (g 간 당 MG) </td></tr><tr><td> Glycosaminoglycans </td><td rowspan="2"> 73.1 ± 6.7 </td><td rowspan="2"> 34.2 ± 2.9 </td><td rowspan="2"> 0.004 </td><td rowspan="2"> 47% </td></tr><tr><td> (g 간 당 MG) </td></tr><tr><td> DNA </td><td rowspan="2"> 14.9 ± 5.6 </td><td rowspan="2"> 0.44 ± 0.08 </td><td rowspan="2"> 3.3 10 -5 </td><td rowspan="2"> 2.9 % </td></tr><tr><td> (g 간 당 MG) </td></tr></tbody></table> 표 1. decellularized 간 매트릭스의 생화 학적 조성은 원래 간 비교. 값은 ± SEM 의미로 표시됩니다

<ol><li>Kulig, K. M., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepatic tissue engineering.</a> Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+native+and+engineered+arterial+scaffolds+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation.</a> Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+a+vascularized+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Engraftment of a vascularized human skin equivalent.</a> FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. , (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 설명된 재관류의 decellularization 방법은 동일한 총 구조와 기본 간 혈관 마이크로 아키텍처를 가지고 전체 간을 발판을 생산하고 있습니다. 발판은 원래 간장과 비슷한 세포외 기질 구성을하고 있습니다. recellularization 방법은 높은 효율성과 세포에서 세포 검사 체외 문화 시대의 동안 가능한 및 기능 유지와 비계의 repopulation을 구현합니다. recellularized 간 이식에 nonparenchymal 세포의 추가와 함께, 우리는 recellularized 간 이식이 같은 약물 대사, 재생 및 개발 등 다양한 간 기능을 연구하기위한 플랫폼으로 사용될 수있는 구상. 그것이 잠재적으로 그라 프트 6 혈관 구조의 존재에받는 동물 감사의 혈액 순환에 연결을 통해 이식 수 있으므로 또한, recellularized 수술이, 임상 응용 프로그램을 찾을 수 있습니다.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=2394">Decellularization and Recellularization of Whole Livers</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.

Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers

<table><tbody><tr><td>소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 디지털 드라이브</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 표준 펌프 헤드</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW- 07013-81</td><td></td></tr><tr><td>버블 트랩(Bubble trap)</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 간은의 decellularization 및 recellularization

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

간은 1 생존하기 위해서는 영양분과 산소와 폐기물의 제거 전달 지속적인 살포가 필요 복잡한 기관이다. 조직 공학 및 microfabrication 기술을 사용하여 접근까지 경내로 간 미세 구조를 재현하거나 모방하는 노력은 지금까지이 디자인 도전으로 인해 성공적으로되지 않았습니다. 또한, 간 조직 공학 응용 프로그램에 대한 공사장 공중 발판을 만드는 데 사용되는 합성 biomaterials 인해 적절한 세포 기능 2 유도 것이 특정 세포 바인딩 작품의 부족으로 많은 부분에서 조직 재생 및 수리를 유도 제한되었습니다. 반면에 Decellularized 기본 tissues 같은 혈관 3 피부에 4 조직 공학에 많은 응용 프로그램을 발견하고 도전 중 일부에 대한 실용적인 솔루션을 제공하고 있습니다. decellularized 기본 행렬의 장점은 따라서 세포 부착 및 개편 5 강화, 정도, 원래 구성 및 미세로 유지한다는 것입니다. 이 작품에서 우리는 방법이 주요 혈관의 구조를 유지 손상 간 bioscaffold가 얻은 것입니다 그러한 간의 재관류 - decellularization을 수행하기 위해 설명합니다. 또한, 우리는 체외에서 기능을하는 간 이식을 만드는, 성인 주요 hepatocytes 이러한 bioscaffolds을 recellularize하는 방법을 설명하고, 생체내에서 이식에 필요한 선박 액세스할 수 있습니다.

재관류의 decellularization는 기관의 세포외 기질 구성과 마이크로 아키텍처를 유지 전체 간 공사장 공중 발판을 생산하는 새로운 기술입니다. 여기에, hepatocytes과 재관류의 decellularization 이후 repopulation를 사용하여 전체 오르간 공사장 공중 발판을 준비하는 방법이 설명되어 있습니다. 기능 및 transplantable 간 이식이 기술을 사용하여 생성할 수 있습니다.

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

간은 생존을 위해 영양소와 산소를 공급하고 노폐물을 제거하기 위한 지속적인 관류가 필요한 복잡한 장기입니다1. ...하기 위한 노력은

본 절차의 전반적인 목적은 탈세포화된 간 매트릭스를 사용하여 탈세포화된 간 이식편을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 공여자 간에 캐뉼라를 삽입함으로써 수행됩니다. 그 후, 일련의 세제 용액을 관류하여 해당 장기를 탈세포화합니다.그 다음, 관류를 통해 성인 일차 간세포를 주입함으로써 탈세포화된 간 매트릭스의 혈관 재형성을 수행합니다. 마지막으로, 세포화된 간 이식편을 배양하기 위해 인 비트로(in vitro) 관류 시스템을 사용합니다. 궁극적으로, 관류 배지 내의 알부민, 요소 및 총 담즙산 분비량을 측정함으로써 크기가 조정된 이식편의 인 비트로(in vitro) 간 기능을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.합성 생체 재료를 이용한 스캐폴드 제작이나 전통적인 조직 공학 기법과 같은 기존 방식에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은, 본인의 의견으로는 조직 특이적인 세포외 기질 조성이 존재한다는 점입니다. 관류 탈세포화 스캐폴드는 혈관 구조와 같은 조직 특이적 미세 구조 또한 유지하고 있습니다. 이러한 혈관 구조의 존재 덕분에 세포를 스캐폴드 내에 더욱 균일하게 재도입할 수 있습니다.또한 이를 통해 영양분을 균일하게 관류하여 세포 생존율을 높일 수 있습니다. 프로토콜의 감속 단계는 저희 실험실의 박사후 연구원인 Nima가 시연할 예정입니다. 재활성화 단계는 역시 박사후 연구원인 Gabriel Price가 시연하겠습니다.그녀의 연구는 이러한 이식편의 산업화에 초점을 맞추고 있습니다. 관류 탈세포화를 수행하기 위해, 먼저 간문맥 캐뉼라 삽입을 통해 쥐의 간을 적출합니다. 18게이지 카테터를 사용하고, 하대정맥과 상대정맥은 열어둡니다. 장기는 10 centimeter 페트리 접시 내의 인산염 완충 식염수(PBS)에 담가 수분을 유지하십시오.다음으로 8L 저장조, 연동 펌프 및 버블 트랩으로 구성된 관류 시스템을 구축합니다. 관류 시스템을 인산염 완충 식염수(PBS)로 채우고 10분 동안 가동합니다. 그런 다음 10cm 페트리 접시에 PBS를 채우고 완충액의 유속을 1.2 mL/min으로 낮춥니다.채취한 간을 PBS가 담긴 페트리 접시에 조심스럽게 옮기고 하룻밤 동안 관류시킵니다. 다음 날, 증류수에 희석한 0.01% sodium ESAL sulfate 또는 SDS를 사용하여 간을 5분 동안 관류합니다.그 후 PBS로 교체하여 1시간 동안 유지합니다. SDS 및 PBS 관류 단계를 3회 더 반복하며, SDS 관류 시간을 10분, 15분, 그리고 마지막에는 20분으로 늘립니다. 그런 다음 0.01% SDS를 사용하여 24시간 동안 간을 관류합니다.0.1% SDS로 24시간 동안 처리합니다. 0.2% SDS로 3시간 동안, 0.5% SDS로 3시간 동안 처리합니다. 증류수로 15분 동안 세척하고, 결합된 핵산을 제거하기 위해 증류수에 희석한 1% Triton X 100으로 30분 동안 처리합니다.마지막으로, 관류가 완료된 후 필요에 따라 PBS로 2시간 동안 세척하여 탈세포화된 간 매트릭스(DLM)를 씻어내고, 중앙엽을 제외한 모든 엽을 절제합니다. 사용 전까지 DLM을 깨끗하게 밀봉된 Petri dish에 담아 PBS와 함께 4°C에서 보관합니다. DLM을 멸균하려면 0.1% per acetic acid와 4% ethanol이 포함된 멸균 PBS로 세척한 후 4°C에서 3시간 동안 배양합니다.다음으로, DLM을 멸균된 PBS로 2회 세척합니다. 그 후 2% penicillin streptomycin(10 µg/mL), gentamycin 및 2.5 µg/mL Amphotericin B가 포함된 PBS로 세척합니다. 탈세포화된 간은 재세포화 실험에 사용하기 전까지 동일한 용액에 넣어 4 °C에서 보관합니다.둘째, 조직 배양 후드 내에서 탈세포화된 간 매트릭스를 세포화합니다. 간을 탈세포화할 때 사용했던 것과 유사한 관류 시스템을 준비하십시오. 관류 시스템에 high glucose DMEM, 10% fetal bovine serum, 100 units/mL penicillin 및 100 µg/mL streptomycin이 포함된 배양액 200 milliliters를 채웁니다.DLM을 관류 챔버에 넣고 펌프를 5 mL/min 속도로 가동하면서 간문맥 캐뉼라를 통해 관류 시스템에 연결합니다. 기포 형성을 방지하기 위해 30분 동안 배지로 DLM을 관류합니다. 그다음, 관류 시스템의 흐름을 멈추고 성체 쥐에서 분리한 간세포 5,000만 개를 버블 트랩을 통해 관류 시스템으로 천천히 주입합니다.흐름을 분당 10 milliliters로 다시 시작하고 배지를 10분 동안 재순환시킵니다. 배지의 흐름을 다시 중단합니다. 5,000만 개의 간세포를 추가로 주입합니다.그런 다음 흐름을 분당 10 milliliters로 다시 시작합니다. 총 200 million 개의 간세포가 DLM에 투입될 때까지 이 절차를 반복합니다. 모든 세포가 DLM에 주입되면, 유출액을 50 milliliter 원심분리 튜브에 수집하고 800 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 펠릿을 하나의 튜브에 모읍니다. 트라이판 블루 배제법(trypan blue exclusion)을 통해 세포 수와 생존율을 측정합니다. 이는 배양을 위한 파종 효율을 설정하기 위함입니다.세포화된 간 이식편. 산소 공급기를 포함하는 멸균 관류 시스템을 구축합니다. 관류 시스템을 5% PBS와 0.5 units/mL의 인슐린이 포함된 Williams E와 같은 배양액 50 milliliters로 채웁니다.EGF 20 ng/mL, 글루카곤 14 ng/mL, 히드로코르티손 7.5 µg/mL, 페니실린 100 units/mL 및 스트렙토마이신 100 µg/mL를 준비합니다. 펌프를 5 mL/min으로 작동시키면서, 세포화된 간 이식편을 관류 챔버에 넣고 문맥 캐뉼라를 통해 관류 시스템에 연결합니다.기포 형성을 방지하기 위해, 무균 상태에서 관류 챔버를 닫고 배양 중 누출이 발생하지 않도록 단단히 밀봉합니다. 관류 시스템을 37 °C, 10% carbon dioxide 조건에서 배양하고 관류 유속을 15 mL/min으로 높입니다. 산소 공급기를 95% oxygen 및 5% carbon dioxide 혼합 가스 탱크에 연결하고, 가스 유속을 0.5 L/min으로 설정합니다.이를 통해 산소 분압을 약 400 mmHg로 유지해야 합니다. 배지를 매일 교체하며 최대 10일 동안 배양을 계속합니다. 배양 기간 종료 시 이식편의 간 기능을 모니터링하기 위해 매일 배지를 채취하여 알부민, 요소 및 총 담즙산 분비량을 측정합니다.분자 및 조직학적 분석을 위해 세포 제거된 간 이식편을 샘플링합니다. 쥐 간의 완전한 탈세포화에는 설명된 프로토콜을 사용하여 약 72시간이 소요됩니다.결과물인 매트릭스는 천연 간의 섬유성 콜라겐 100%, 글리코아미노글리칸 50%, 그리고 DNA의 5%만을 유지합니다. 매트릭스의 혈관 구조는 부식 주조법과 주사 전자 현미경 분석을 통해 확인된 바와 같이 보존됩니다. DLM 내 혈관 미세구조의 존재는 96%의 효율로 세포를 재정착시키고 이후 관류하는 것을 용이하게 합니다.in vitro 배양의 경우, 재세포화된 간 이식편은 최대 10일 동안 in vitro 배양될 수 있으며, 알부민, 요소 및 총 담즙산 분비를 통해 확인된 적절한 간 기능을 나타냅니다. 따라서 이 영상을 시청하신 후에는 전체 간을 탈세포화하고 재세포화하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

decellularization-and-recellularization-of-whole-livers

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

간 sinusoidal 내피 세포 (초)의 연구는 더 셀 라인이 존재하지 않는 등 동물에서 얻은 기본 세포로 수행되어야합니다. 이 방법은 이후 culturing 및 실험에 대한 SEC의 정화를 위해 간 소화 및 차등 원심 분리에 의존하고 있습니다.

간 재관류에 의한 간 세포의 정화를 얹는 생체내 간 Endocytosis에서

신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.

퇴행성 관상 재관류에 의한 돼지 심장의 Decellularization 절차

이 문서는 쥐의 소장에서 무 세포 매트릭스의 제조 방법을 설명합니다. 장 비계의 유도는 세포 생물학 및 약물 검사 줄기, 조직 공학의 미래 응용 프로그램에 중요합니다.

자연 무 세포 창자 매트릭스의 생산을위한 탈세 포화 방법론

전체 장기 탈세포화는 재생 의학에 사용될 수 있는 자연적인 생물학적 골격을 생성합니다. 폐 재생의 비인간 영장류 모델에 대한 설명이 제시되는데, 이는 전체 폐가 탈세포화되고 성체 줄기 세포와 내피 세포를 파종하여 혈관 순환과 액체 매체 환기를 촉진하는 생물 반응기에 파종되는 것입니다.

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화)

당사의 독점 장치를 사용하여 간 채취, 삽관 및 관류를 위한 제시된 기술은 쥐 간에서 탈세포화 및 재세포화 실험을 개선하기 위한 정교한 관류 설정을 가능하게 합니다.

진동 압 관류 장치에서 쥐 간을의 탈세 포화 절차

이 프로토콜은 혈관 구조를 통한 세제의 사전 관류에 의한 Sprague Dawley 쥐 신장의 탈세포화를 설명하며, 인간 신장 상피 세포로 재증식하기 위한 템플릿 역할을 하는 무세포 신세포 외 기질을 생성합니다. 성장을 모니터링하기 위한 재세포화 및 레사주린 관류 분석법의 사용은 특별히 설계된 관류 생물반응기 내에서 수행됩니다.

상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

탈세포화된 쥐 간의 재세포화된 세포외 기질은 바이러스 또는 바이러스 벡터의 분포 및 전이유전자 발현을 연구하기 위해 인간화된 3차원 생체 외 모델로 사용할 수 있습니다.

인간의 간세포 암 세포주 인 HepG2와 3 차원 간 모델 다시 채워에서 바이러스 성 벡터의 연구

여기, 우리 주변 혈액과 내 피 매체의 관류 하 여 세제 및 recellularization를 사용 하 여 saphenous 정 맥 decellularization에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

Decellularization 및 Recellularization 방법론을 인간의 Saphenous 정 맥에 대 한

우리 더 vivo에서 부분 간 미래에 엔지니어링을 공부에 대 한 전제 조건으로 쥐에서 vivo에서 단일 간 엽 관류 모델에 대 한 새로운 수술 기법을 설정 합니다.

Vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐를 기초로 새로운 수술 기법

이 메서드는 decellularization의 삼투성 충격 및 최소한의 기관 매트릭스 중단 이온 세제의 관류에 따라 간단한 프로토콜을 사용 하 여 복잡 한 단단한 기관 수 있습니다. 그것은 흐름 역학 및 세포질 파편 유출의 실시간 모니터링으로 가압된 주머니 안에 인간의 마음에 대 한 소설 decellularization 기법으로를 구성 됩니다.

거꾸로 방향 가압된 주머니 안에 전체 인간의 마음의 decellularization

이 프로토콜은 마우스의 심장과 폐를 탈세포화하는 것을 목표로합니다. 생성된 세포외 매트릭스(ECM) 스캐폴드는 면역염색및 이미지화되어 구성요소의 위치와 토폴로지를 매핑할 수 있다.

뮤린 심폐 복합체의 탈세포화

배우세요 전체 간의 perfusion decellularization 및 hepatocyte 재세포화 기술을 통해 기능성 간 이식편을 제조하는 방법을. 이 기법은 세포외기질과 미세구조를 보존하여 재생의학 및 장기공학 연구에 활용됩니다.

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

더 많은 동영상 탐색