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미생물학
0 조회수 • 3:16 분 • August 29th, 2025
무기 폴리인산염(polyP)은 박테리아 독성 및 스트레스 반응에 관여하는 선형 인산염 중합체로 세포질 과립으로 저장됩니다.
polyP를 정량화하려면 무기 인산염 표준물질의 농도가 증가하는 멀티웰 플레이트를 사용합니다.
정제된 박테리아 폴리 P 추출물을 빈 우물에 첨가하십시오.
엑소폴리포스파타제 효소를 함유한 반응 완충액을 각 웰에 도입하고 배양합니다.
효소는 polyP를 유리 무기 인산염으로 절단하여 정량화 가능한 형태로 전환합니다.
몰리브덴산염과 아스코르브산을 함유한 검출 시약을 첨가하고 배양합니다.
몰리브덴산염은 인산염과 반응하여 인산염 복합체를 형성하며, 이는 아스코르브산에 의해 청색 복합체로 환원됩니다.
유색 복합체의 흡광도를 측정합니다. 측정된 흡광도는 인산염 농도에 정비례하는 청색 강도에 해당합니다.
표준 곡선을 생성하고 박테리아의 원래 polyP 함량을 반영하여 샘플의 인산염 수준을 계산합니다.
50밀리몰 pH 8트리스염산염에 0, 5, 50 또는 200마이크로몰 인산칼륨을 함유한 표준물질을 준비하는 것으로 시작합니다.
각 인산염 표준물질 100마이크로리터와 추출된 폴리P 샘플 100마이크로리터를 투명한 96웰 플레이트의 별도 웰에 분취합니다. 샘플당 30마이크로리터의 5X ScPPX 반응 완충액, 19마이크로리터의 물 및 1마이크로리터의 정제된 ScPPX를 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 50마이크로리터의 마스터 믹스를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
그리고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 검출 당일, 검출액 베이스 9.12ml와 1몰 아스코르브산 88ml를 혼합하여 검출액의 새로운 작업 스톡을 준비하고 실온에 올린 후 사용하십시오. 96웰 플레이트의 각 샘플 및 표준물질에 50마이크로리터의 검출 용액을 추가합니다.
발색을 허용하려면 플레이트를 실온에서 약 2분 동안 배양합니다. 플레이트 리더를 사용하여 882나노미터에서 흡광도를 측정하고 인산칼륨 표준 곡선과 비교하여 각 샘플의 인산염 농도를 계산합니다. 그런 다음 원고에 설명된 대로 각 세포 용해물에서 인산염 농도를 polyP 유래 인산염의 나노몰로 변환하고 세포 polyP 함량을 총 세포 단백질로 정규화합니다.