0 조회수 • 3:12 분 • August 29th, 2025
두꺼운 펩티도글리칸 세포벽을 가진 박테리아인 황색포도상구균 배양을 취하십시오.
항생제가 함유된 신선한 배지에서 배양액을 희석하고 진흔하면서 따뜻한 온도에서 배양하여 박테리아 성장을 촉진합니다.
배양액을 튜브로 옮기고 원심분리하여 박테리아를 펠릿화합니다.
상청액을 버리고 펠릿을 얼음 위에 올려 박테리아가 손상되지 않도록 보호합니다.
펠릿을 용해 완충액에 재현탁하고 실리카 비드가 들어 있는 튜브로 옮깁니다.
튜브를 기계식 세포 용해 기기에 삽입하고 교반을 시작합니다.
박테리아와 비드 사이의 빠른 충돌은 전단력을 생성합니다. 이것은 박테리아를 용해시켜 DNA, RNA 및 RNA-단백질 복합체를 방출합니다.
용해 완충액의 이온은 RNA 구조를 안정화하는 반면, 완충액의 환원제는 RNA 분해 효소를 비활성화합니다.
이제 혼합물을 다시 원심분리하여 파편을 펠릿화합니다.
추가 분석을 위해 핵산과 단백질을 포함하는 상청액을 수집합니다.
마이크로리터당 10마이크로그램의 에리스로마이신을 보충한 BHI 배지 3밀리리터에서 pCN51 P3 MS2 sRNA 또는 pCN51 P3 MS2 플라스미드를 운반하는 균주 1군집을 성장시킵니다.
에리스로마이신이 보충된 신선한 BHI 배지 50밀리리터에 각 하룻밤 배양액을 희석하여 OD 600 0.05에 도달합니다. 섭씨 37도에서 180RPM으로 6시간 동안 흔들어 배양물을 성장시킵니다. 각 배양액을 50밀리리터 원심분리관으로 옮기고 튜브를 섭씨 4도에서 15분 동안 2, 900배 G로 원심분리한 후 상청액을 버리고 영하 80도에서 동결 및 보관하거나 펠릿을 얼음 위에 보관하고 기계적 세포 용해를 직접 수행합니다.
기계적 세포 용해를 수행하려면 펠릿을 5밀리리터의 완충액 A에 재현탁하고 재현탁된 세포를 3.5g의 실리카 비드가 있는 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 기계식 세포 용해 기기에 삽입하고 초당 4미터로 40초 주기를 실행합니다. 튜브를 2,900배 G에서 15분 동안 원심분리한 다음 상청액을 회수하여 얼음 위에 보관합니다.
상청액이 깨끗한지 확인하고, 그렇지 않은 경우 원심분리를 반복합니다.