친화성 정제를 사용한 작은 조절 RNA 결합 박테리아 표적 RNA 분리

표적 RNA에 결합된 MS2 태그 sRNA를 포함하여 세포 성분을 포함하는 박테리아 세포 용해물을 섭취하십시오.

MS2 태그 sRNA는 MS2 바이러스 코트 단백질에 대한 높은 친화력을 나타내는 5' 말단에 MS2 압타머 줄기 루프를 운반하는 조작된 작은 조절 RNA입니다.

박테리아 용해물을 맥아당 결합 단백질(MBP)과 MS2 코트 단백질로 구성된 융합 단백질에 결합된 아밀로스 수지가 포함된 사전 평형화된 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 옮깁니다.

고정화된 MS2 코트 단백질은 MS2 태그가 부착된 sRNA의 압타머 줄기 루프를 특이적으로 포획하여 온전한 표적 RNA 결합 sRNA를 유지합니다.

결합되지 않은 상태로 남아 있는 태그가 지정되지 않은 분자는 플로우 스루에 수집됩니다.

잔

여 결합되지 않은 분자를 제거하기 위해 버퍼로 컬럼을 세척합니다.

수지에서 MBP를 대체하는 맥아당을 함유한 완충액으로 용리하여 표적 RNA에 결합된 MS2 태그 sRNA를 방출합니다.

다운스트림 분석을 위해 RNA 무결성을 보존하기 위해 분획을 수집하고 얼음 위에 보관합니다.

컬럼 팁을 제거한 다음 크로마토그래피 컬럼을 컬럼 랙에 넣고 초순수로 컬럼을 세척합니다. 300마이크로리터의 아밀로스 수지를 첨가하고 10밀리리터의 완충액 A로 컬럼을 세척합니다. 6밀리리터의 완충액 A에 MBP-MS2 단백질의 1, 200피카몰을 희석하고 컬럼에 로드합니다.

10밀리리터의 완충액 A로 컬럼을 세척합니다. 다음으로 MS2 친화성 정제를 수행합니다. 세포 용해물을 컬럼에 로드하고 깨끗한 수집 튜브에 유동 분획을 수집합니다. 10밀리리터의 완충액 A로 컬럼을 3회 세척하고 세척 분획을 수집한 다음 1밀리리터의 완충액 E로 컬럼을 용리하고 용출 분획을 2밀리리터 마이크로튜브에 수집합니다.

RNA 추출이 될 때까지 수집된 모든 분획을 얼음 위에 보관하십시오.