Mycobacterium tuberculosis에서 Siderophore 함유 세포외 소포의 분리

0 조회수3:46 • September 26th, 2025

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철 킬레이트제인 철 킬레이트 인 철 세포를 포함하는 세포외 소포의 분비를 강화하기 위해 철 제한 배지에서 성장 된 Mycobacterium tuberculosis 배양을 섭취하십시오.

박테리아를 펠릿화하기 위해 원심분리기.

상청액을 모아 여과하여 잔류 박테리아를 제거합니다.

여과액을 교반된 한외여과 시스템으로 옮기고 여과하여 과도한 배지를 제거하고 EV를 농축합니다.

농축액을 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.

상청액을 초원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리하여 EV 펠릿을 수집합니다.

상청액을 버리고 펠릿을 완충액에 재현탁한 다음 농축된 밀도 구배 배지와 혼합하여 바닥층을 형성합니다.

불연속적인 밀도 구배를 만들기 위해 기울기 매질의 농도를 감소시키는 오버레이.

상단에 완충액을 추가하고 원심분리합니다. EV는 부력 밀도와 일치하는 층으로 이동합니다.

각 분획을 별도의 튜브에 수집합니다.

철포어 함유 EV가 있는 정제된 분획은 다운스트림 연구에 사용할 준비가 되었습니다.

배양액을 5개의 225밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 20도에서 7분 동안 2,850배g으로 원심분리합니다. 50밀리리터 피펫으로 배양 상청액을 수집하고 0.22미크론 필터를 통해 여과하여 멸균합니다.

MEV를 분리하려면 배양 여과액을 섭씨 4도에 배치된 교반 세포 한외여과 시스템으로 옮기고 100킬로달톤 차단막을 통해 50PSI 미만의 압력에서 농축액을 여과합니다. 그런 다음 농축된 배양 여과액을 섭씨 4도에서 15분 동안 15,000배 g으로 원심분리하고 폴리카보네이트 초원심분리 튜브에 상청액을 수집합니다. 상층액을 섭씨 4도에서 2시간 동안 100,000배 g으로 원심분리합니다.

그 후, 상청액을 제거하고 부드러운 피펫팅을 통해 총 1밀리리터의 멸균 PBS에 막 펠릿을 재현탁합니다. 폴리프로필렌 얇은 벽으로 된 초원심분리기 튜브의 바닥에 펠릿 현탁액 0.5밀리리터와 60% 요오딕산올 용액 1.5밀리리터를 혼합합니다. 이 MEV 요오딕산올 45% 현탁액을 40%, 35%, 30%, 25% 및 20% 요오딕산올 용액 1밀리리터와 상단에 PBS 1밀리리터와 겹쳐 놓습니다.

섭씨 4도에서 18시간 동안 100,000배 g으로 원심분리합니다. 그런 다음 1밀리리터 해밀턴 주사기를 사용하여 위에서 시작하여 1밀리리터 밀도 구배 분획을 수집합니다. 수집된 각 분획을 PBS로 20밀리리터로 희석하고 섭씨 4도에서 2시간 동안 100,000배g으로 원심분리합니다.

상청액을 제거하고 0.5밀리리터의 PBS에 재현탁합니다.

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마지막 업데이트: 1 8월 2026