크기배제 크로마토그래피를 이용한 박테리아 세포외 소포의 분리

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미생물학

0 조회수 • 3:24 분 • September 26th, 2025

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정의된 크기의 다공성 수지 비드로 충전된 크기 배제 크로마토그래피 또는 SEC 컬럼을 사용합니다. 상단에 샘플 저장소가 포함되어 있습니다.

인산염 완충 식염수 또는 PBS를 첨가하여 컬럼 비드의 평형을 유지하고 플로우 스루를 버립니다.

세포외 소포 또는 EV, 분비된 단백질 및 오염 물질이 포함된 농축된 박테리아 배양 여과액을 로드합니다.

EV는 생리 활성 분자를 운반하고 박테리아에 의해 분비되는 지질 기반 나노소포입니다.

여과액이 비드에 들어가면 PBS를 첨가하여 수지 베드를 통과시킵니다.

큰 비소포성 오염 물질이 포함된 초기 용출액을 폐기합니다.

배출구 아래에 수집 튜브를 놓고 PBS를 순차적으로 추가합니다.

대형 EV는 더 작은 수지 기공을 회피하고 비드 사이의 입자 간 공간을 통해 이동한 다음 먼저 용리됩니다.

더 작은 단백질과 오염 물질은 모공으로 들어가 더 긴 경로를 따라 나중에 용출됩니다.

EV를 포함하는 초기 용출 분획을 수집하여 분석을 위해 보관합니다.

EV를 분리하기 위해 100밀리리터 미만의 출발 물질에 대해 10밀리리터 베드 부피의 작은 컬럼과 100밀리리터 이상의 출발 물질에 대해 47밀리리터 베드 부피의 더 큰 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행합니다. 실험 몇 시간 전에 SEC 컬럼과 PBS를 실온에 둔 다음 표준 실험실 스탠드와 홀더를 사용하여 컬럼을 수직 위치로 안정화합니다. SEC 컬럼에 연결하기 전에 5밀리리터의 PBS가 프릿을 통해 폐기물 용기로 흐르도록 하여 샘플 저장소를 수화시킵니다.

그런 다음 컬럼의 입구 캡을 풀어 샘플 저장소에 PBS 2밀리리터를 추가하고 PBS가 프릿을 통해 떨어질 때 저장소를 컬럼에 조심스럽게 연결합니다. 컬럼의 평형을 위해 시료 저장소에 47밀리리터의 PBS를 첨가한 다음 SEC 컬럼 바닥의 캡을 풉니다. 그런 다음 로드된 모든 샘플 버퍼가 컬럼을 통해 흐르도록 하고 흐름을 버립니다.

2밀리리터의 샘플을 샘플 저장소에 로드한 후 샘플이 컬럼에 완전히 들어가 흐름을 수집하도록 합니다. PBS를 시료 저장소에 시료 부피를 뺀 14.25밀리리터의 부피로 즉시 첨가하여 용액이 컬럼을 통해 흐르도록 하고 컬럼 보이드 부피와 동일한 양은 폐기합니다. 다음으로, 2밀리리터의 PBS가 컬럼을 통과하도록 허용한 후 첫 번째 플로우 스루 또는 분획 1을 수집하기 위해 SEC 컬럼 바로 아래에 배치합니다.

샘플 저장소에 2밀리리터의 PBS를 계속 추가하여 각 후속 분획을 수집합니다. 수집된 분획은 단기 보관의 경우 섭씨 4도, 장기 보관의 경우 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026