면역학적 시냅스 형성을 통한 T 세포의 시험관 내 세균 이식

난알부민 펩타이드 또는 OVAp에 특이적인 수용체를 발현하는 CD4⁺ T 세포를 포함하는 웰로 시작합니다.

음성 대조군 웰에 다공성 멤브레인 인서트를 넣습니다.

튜브에 박테리아에 감염되고 표면 제시를 위해 OVAp가 로드된 수지상 세포를 채취합니다.

수지상 세포를 테스트 웰과 음성 대조군 웰의 삽입물에 직접 추가합니다.

웰에 배지를 추가하고 배양합니다.

테스트 우물에서 세포는 상호 작용하여 면역학적 시냅스를 형성하여 수지상 세포에서 T 세포로의 박테리아 전달을 촉진하며, 이는 이식으로 알려진 과정입니다.

음성 대조군 웰에서 막 장벽은 세포-세포 상호작용을 방지하여 이식을 억제합니다.

항생제 겐타마이신을 웰에 넣고 배양합니다.

겐타마이신은 진핵 세포에 침투할 수 없으므로 내재화된 박테리아는 생존하는 동안 내재화되지 않은 박테리아만 죽입니다.

감염된 T 세포를 포함하는 테스트 샘플과 감염되지 않은 T 세포가 포함된 대조군 샘플은 이제 T 세포 분리 및 이식 정량화를 위한 준비가 되었습니다.

24웰 배양 플레이트에 5개의 웰 각각에 0.5밀리리터의 부피로 200만 개의 CD4⁺ T 세포를 추가합니다.

다음으로, 물리적 접촉을 제어하기 위해 기공 크기가 3마이크로미터인 폴리카보네이트 트랜스웰 장벽을 세 번째 및 네 번째 웰에 배치합니다. 첫 번째 웰에 감염된 과부하 수지상 세포 0.1밀리리터를 추가합니다. 두 번째 웰에 감염된 로드되지 않은 수지상 세포 0.1밀리리터를 추가합니다.

감염된 과부하 수지상 세포 0.1 밀리리터를 한 웰에 추가하고, 감염된 비로드 수지상 세포 0.1 밀리리터를 다른 웰에 추가합니다. 마지막으로, 음성 대조군으로서, MOI 10에서 CD4⁺ T 세포의 다섯 번째 웰을 직접 감염시킵니다. 그런 다음 RPMI를 사용하여 우물의 총 부피를 최대 0.6밀리리터로 가져옵니다.

면역 시냅스가 형성될 수 있도록 플레이트를 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 각 웰에 배지 밀리리터당 100마이크로그램의 겐타마이신을 첨가하고 1시간 동안 배양합니다. 겐타마이신은 진핵 세포에 침투할 수 없는 아미노글리코사이드 항생제입니다.

따라서 이 단계에서 아미노글리코사이드는 세포외 박테리아를 죽이지만 세포내 박테리아는 죽이지 않습니다.