제브라피쉬 배아에서 생체 재료 관련 세균 감염의 형광 이미징

생체 내에서 생체 재료 관련 감염을 모델링하기 위해 형광 표지된 병원성 박테리아를 단독으로 또는 생체 재료 마이크로스피어와 혼합하여 주입한 마취된 제브라피쉬 배아로 시작합니다.

마취제가 포함된 기초 배지가 들어 있는 페트리 접시를 적절한 필터가 장착된 실체 형광 현미경의 스테이지에 놓습니다.

접시에 메틸셀룰로오스 용액을 첨가하여 이미징을 위해 배아를 고정시키는 점성 배지를 만듭니다.

개별 배아를 메틸셀룰로오스에 옮기고 수평으로 정렬하여 주사 부위가 보이도록 합니다.

명시야 필터를 사용하여 감염 부위를 표적으로 삼기 위해 주사 부위에 초점을 맞춥니다.

Z-스택 이미징 매개변수를 설정하고 다양한 깊이에서 형광 이미지를 획득하여 감염 역학을 3차원으로 캡처합니다.

소프트웨어를 사용하여 시간이 지남에 따라 캡처된 이미지를 분석하여 형광 강도를 정량화하고 박테리아 분포를 모니터링합니다.

이 프로토콜을 사용하면 생체 재료 노출이 있거나 없는 살아있는 배아에서 감염 진행을 직접 비교할 수 있습니다.

0.02% 트리카인이 보충된 E3 배지가 들어 있는 100mm 페트리 접시를 실체 형광 현미경 스테이지에 놓고 500마이크로리터의 2% 메틸셀룰로오스를 페트리 접시에 첨가합니다. 형광 현미경으로 감염 진행 상황을 모니터링하려면 적절한 명시야 및 형광 필터를 장착하고 마취된 감염된 배아를 페트리 접시의 메틸셀룰로오스 지점에 수평으로 정렬합니다.

명시야 필터를 사용하여 손상된 주입 조직에 160배 배율로 초점을 맞춥니다. Z-스택 깊이를 10마이크로미터로, 스텝 크기를 5마이크로미터로 설정하여 3개의 연속 이미지를 기록할 수 있습니다. 그런 다음 160배 배율로 동일한 최적화된 설정에서 개별 배아를 이미지화합니다.

ImageJ에서 ObjectJ 플러그인을 사용하여 이미지를 분석합니다.