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미생물학
0 조회수 • 2:27 분 • September 26th, 2025
항생제 선택 배지에서 재조합 녹농균 배양으로 시작합니다.
이 박테리아는 결실을 위한 박테리아 표적 유전자 근처의 게놈에 통합된 비복제 플라스미드를 보유하고 있습니다.
통합은 플라스미드와 게놈 간에 공유되는 상동 서열을 통해 발생하여 단일 교차 재조합을 초래했습니다.
플라스미드는 항생제 내성 유전자와 자당 민감성을 부여하는 sacB 유전자를 암호화합니다.
자당이 포함되어 있지만 항생제가 없는 배지에 박테리아를 줄무늬로 만들고 배양합니다.
항생제 압력이 없으면 상동 영역 간에 두 번째 재조합 또는 이중 교차가 발생하여 플라스미드와 표적 유전자가 절제됩니다.
박테리아가 증식하는 동안 절제된 플라스미드는 전달되지 않아 박테리아가 자당 내성을 갖게 됩니다.
박테리아를 비선택적 배지와 자당 또는 항생제를 함유한 배지에 패치하고 배양합니다.
항생제 배지가 아닌 비선택적 및 자당 배지에서의 성장은 성공적인 이중 교차를 확인합니다.
Pseudomonas Isolation Broth(PIB)에서 단일 교차 재조합 콜로니를 성장시키는 것부터 시작하십시오. 10% 자당을 보충한 미리 예열된 PIA 플레이트에 각 배양액 10마이크로리터를 접종하고 줄무늬로 만듭니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.
다음날 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 성장 여부를 검사합니다. 자당 저항성 콜로니는 이중 교차 재조합체여야 합니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 미리 예열된 PIA, 10% 자당이 보충된 PIA 및 카르베니실린이 보충된 PIA의 플레이트에 최소 20개의 콜로니를 패치합니다.
플레이트를 밤새 배양하고 다음날 성장 여부를 검사합니다. 진정한 이중 교차 재조합체는 카르베니실린에 민감하고 자당에 내성이 있습니다.