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미생물학
0 조회수 • 5:46 분 • September 26th, 2025
균사 형성 박테리아인 Streptomyces venezuelae의 포자가 들어 있는 우물이 있는 미세유체 플레이트를 가져 가십시오.
다른 지정된 우물에는 영양이 풍부하거나 사용한 배지가 포함되어 있습니다.
포자는 각각 균사 끝과 가로벽에 국한되는 형광 DivIVA 및 FtsZ 단백질을 발현하는 균주에서 파생됩니다.
도립 현미경의 대물 렌즈와 플레이트의 이미징 창에 침지 오일을 바릅니다.
현미경 스테이지에 플레이트를 장착하고 타임랩스 이미징을 시작합니다.
포자를 플레이트의 배양 챔버에 넣습니다.
그런 다음 영양이 풍부한 배지를 도입하여 포자 발아를 시작합니다.
균사가 자라면서 DivIVA는 균사 끝에 축적되고 FtsZ는 가로벽에 흩어져 있는 고리를 형성합니다.
다음으로 사용한 매체로 전환합니다. 이 배지의 영양소 부족은 포자 형성을 지원합니다.
발아 균사에서 DivIVA 병소는 사라지고 FtsZ는 분열 고리의 규칙적인 사다리로 재편성되어 포자 형성 중격을 형성합니다.
시간이 지남에 따라 동일한 균사에서 FtsZ 형광이 사라지면 포자 형성이 완료되었음을 확인할 수 있습니다.
환경 챔버를 미리 섭씨 30도로 예열하십시오.
그런 다음 현미경과 현미경 제어 소프트웨어를 켭니다. 높은 개구수 오일 침지 대물렌즈를 제자리에 놓고 노란색 형광 및 적색 형광 단백질 융합 이미지와 함께 미분 간섭 대비 이미지를 획득하도록 설정된 적절한 필터 및 다이어그램 미러가 제자리에 있는지 확인합니다. 대물렌즈와 미세유체 플레이트의 이미징 창 하단에도 침지 오일 한 방울을 놓습니다.
밀봉된 미세유체 장치를 도립 현미경의 스테이지에 조심스럽게 장착하고 제자리에 고정합니다. 내장된 위치 마커를 사용하여 미세유체 배양 챔버의 이미징 창에 초점을 맞춥니다. A로 표시된 첫 번째 흐름 챔버의 가장 왼쪽 부분에 초점을 맞춘 다음 스테이지를 트랩 높이 0.7마이크로미터에 해당하는 트랩 크기 5로 이동합니다.
미세유체 소프트웨어에서 15초 동안 4psi에서 입구 웰 8에서 셀을 로드하도록 시스템을 설정합니다. 프로세스가 실행된 후 이미징 창을 가로질러 스테이지를 이동하여 배양 챔버의 세포 밀도를 확인합니다. 포자가 포획되지 않은 경우, 세포 로딩 단계를 반복하거나, 이미징 창당 1개에서 10개의 포자의 원하는 세포 밀도에 도달할 때까지 로딩 압력 및/또는 시간을 증가시킨다.
배양실에 과부하가 걸리지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 제어 소프트웨어에서 이전에 준비된 흐름 프로그램을 시작하고 이미지 획득을 시작하기 전에 현미경 단계에서 미세유체 플레이트가 1시간 동안 열 평형을 이루도록 합니다. 현미경 제어 소프트웨어에서 먼저 이미지 파일의 자동 저장을 위한 디렉토리를 지정하여 시간이 지남에 따라 여러 스테이지 위치에서 여러 이미지를 촬영하도록 다차원 획득을 설정합니다.
그런 다음 조명 설정으로 이동하여 각 특정 구조에 대해 미리 결정된 최적의 조명 설정을 입력합니다. 그런 다음 24시간 동안 40분마다 이미지를 수집하도록 시계열을 설정합니다. 스테이지 위치를 결정하고 자동 초점을 설정하려면 배양 챔버를 스캔하고 관심 있는 각 이미징 위치에 대한 스테이지 위치를 저장합니다.
단일 s를 확인하십시오.tage 위치 광표백 및 광독성을 최소화할 수 있을 만큼 충분히 멀리 떨어져 있습니다. 선택한 스테이지 위치의 Z 좌표가 확인되면 하드웨어 자동 초점을 활성화합니다. 그런 다음 현미경 제어 소프트웨어에서 타임랩스 실험을 시작합니다.
24-30시간 후 또는 관심 영역의 균사가 포자로 분화한 후 이미지 획득을 중지합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 흐름 프로그램을 중지하고 미세유체 장치를 분해합니다. 입구 웰, 폐기물 웰 및 셀 로딩 웰에서 남아 있는 배지를 제거하여 단기 보관을 위해 사용된 미세유체 플레이트를 준비합니다.
그런 다음 레인 A의 사용한 우물과 사용하지 않는 레인의 우물을 멸균 PBS로 채웁니다. 마지막으로 접시가 마르지 않도록 배 필름으로 밀봉합니다. 그리고 접시를 섭씨 4도에서 보관하십시오.