식물 세포의 박테리아 감염 및 이펙터 단백질 전달 모니터링

슈퍼폴더 녹색 형광 단백질 또는 sfGFP의 큰 비형광 단편을 발현하는 유전자 변형 잎 영역이 있는 실험 식물로 시작합니다.

sfGFP의 작은 비형광 단편으로 태그가 지정된 이펙터 단백질을 포함하는 슈도모나스 박테리아를 이러한 변형된 영역에 주입합니다.

박테리아와 잎 세포 사이의 상호 작용을 허용하기 위해 배양합니다.

슈 도모나스 는 특수한 분비 시스템을 사용하여 태그가 지정된 이펙터 단백질을 잎의 세포질로 전달합니다.

큰 GFP 단편과 작은 GFP 단편 사이의 근접성은 기능적 형광 sfGFP로 조립된 다음 원형질막으로 전위될 수 있습니다.

배양 후 주입 부위에서 잎 디스크를 절제합니다.

레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 이 디스크를 시각화합니다.

처음에는 자가형광을 최소화하기 위해 낮은 레이저 강도로 리프 디스크를 이미지화합니다. 그런 다음 레이저 출력을 높여 가시성을 높이십시오.

녹색 형광은 성공적인 박테리아 감염과 식물 세포로의 이펙터 단백질 전달을 확인합니다.

Nicotiana benthamiana 잎의 경우 이틀 전에 Agrobacterium이 침투한 것과 동일한 영역에 Pseudomonas 현탁액을 침투시킵니다.

마지막으로 슈도모나스에 접종된 잎에서 잎 디스크를 잘라냅니다. 슈도모나스 침투 후 특정 시점에서 공초점 레이저 스캐닝 시스템을 사용하여 단일 식물에서 2개의 2제곱센티미터 잎 디스크를 이미지화합니다. 상처로 인해 죽은 세포가 죽지 않도록 침윤 구멍에서 멀리 떨어진 세포를 관찰하십시오.

박테리아의 전위 이펙터는 매우 적은 양으로만 존재합니다. 따라서 레이저 출력을 높이고 형광 방출을 얻어 형광 신호를 감지할 수 있습니다. 그러나 식물 세포의 자가형광으로 인한 잘못된 신호를 포착하지 않도록 과도하게 강력하지 마십시오.