0 조회수 • 3:21 분 • September 26th, 2025
마취된 제브라피쉬 유충이 들어 있는 접시를 가져 가십시오.
유충 위에 저융점 아가로스 한 방울을 바르고 주사 중에 장이 접근할 수 있도록 측면으로 부드럽게 배치합니다.
이제 아가로스를 잠시 식혀 굳히게 하여 유충을 고정시킵니다.
마취 상태에서 유충을 유지하기 위해 마취제가 포함된 배지를 추가합니다.
다음으로, 병원성 박테리아인 형광 표지된 클로스트리디오이데스 디피실의 현탁액을 취하고 주사 모니터링을 용이하게 하기 위해 추적 염료를 첨가합니다.
이 혼합물을 미세 주입 바늘에 넣고 바늘을 미세 조작기에 장착합니다.
실체현미경으로 바늘을 유충 장을 향하는 각도로 배치합니다.
그런 다음 바늘 끝을 장 내강에 부드럽게 삽입합니다.
박테리아를 내강에 직접 주입하고 추적 염료를 사용하여 성공적인 전달을 확인합니다. 그런 다음 바늘을 집어넣습니다.
형광 현미경을 사용하여 유충 장에서 Clostridioides difficile 의 위치를 확인합니다.
먼저 0.8% 저융점 아가로스를 페트리 접시에 제브라피쉬 유충 위에 떨어뜨려 덮습니다. 유충을 측면 위치로 부드럽게 조정하십시오. 페트리 접시를 얼음 위에 30-60초 동안 올려 저융점 아가로스가 응고되도록 합니다.
아가로스를 덮기 위해 0.02%에서 0.04%의 트리카인을 함유한 30% Danieau's 배지를 첨가합니다. 주사 용액을 준비하려면 PBS 용액에 있는 0.5% 페놀 레드 1마이크로리터를 염료 염색된 Clostridioides difficile 접종물 9마이크로리터에 첨가합니다. Microloader를 사용하여 보정된 Microinjection 바늘에 주입 용액을 로드합니다.
로드된 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고 실체 현미경 아래에 배치합니다. 사출 압력을 600에서 900헥토파스칼 사이로 조정합니다. 주입 시간을 0.1 - 0.3초로 설정하여 0.5 - 1.0 나노리터를 얻습니다.
마이크로매니퓰레이터의 바늘을 약 45도 각도로 설정하여 내장된 유충을 가리킵니다. 바늘 끝을 위장관 위, 비뇨생식기 모공에 가깝게 놓습니다. 아가로스를 뚫은 다음 바늘 끝으로 근육을 뚫습니다.
그런 다음 장 내강에 삽입하고 0.5-1.0나노리터의 클로스트리디오이데스 디피실을 주입합니다. 형광 현미경을 사용하여 주입된 유충을 모니터링하고 유연한 마이크로로더 팁을 사용하여 공초점 이미징을 위해 적절하게 주입된 유충을 픽업합니다.