생물발광 장출혈성 대장균 접종물의 제조

병원성 장내 박테리아인 장출혈성 대장균 또는 EHEC의 냉동 재고로 시작하십시오.

이 박테리아는 실시간 생물발광 이미징을 위한 루시페라아제를 발현하는 플라스미드와 선택을 위한 항생제 내성 유전자를 운반합니다.

적절한 항생제가 들어 있는 한천 플레이트에 박테리아를 줄무늬로 만들고 배양하여 개별 플라스미드 함유 콜로니를 분리합니다.

단일 콜로니를 골라 항생제가 보충된 국물에서 배양합니다. 유전적으로 균일하고 플라스미드에 안정한 집단을 번식시키기 위해 배양합니다.

대수 성장에서 세포를 동기화하기 위해 폭기 조건에서 배양을 확장합니다.

원하는 광학 밀도에 도달할 때까지 박테리아 성장을 모니터링합니다.

다음으로, 배양물을 원심분리하여 박테리아를 펠릿화합니다.

상청액을 제거하고 멸균 식염수로 펠릿을 세척합니다.

다시 원심분리기. 상청액을 버리고 펠릿을 더 적은 양의 식염수에 재현탁합니다.

이 농축된 EHEC 현탁액은 이제 생물발광 기반 추적이 가능합니다.

시작하려면 루시페라아제 플라스미드를 보유한 섭씨 음의 80 도 배균 O157 H7 EDL933 박테리아를 카나마이신 밀리리터당 50마이크로그램이 포함된 LB 한천 플레이트에 줄무늬로 줄무늬로 만듭니다. 섭씨 37도에서 16-18시간 동안 박테리아를 성장시킵니다. 하룻밤 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 LB 배지 3밀리리터에 카나마이신 밀리리터당 50마이크로그램을 접종합니다.

그런 다음 배양액을 섭씨 37도 및 220rpm에서 16-18시간 동안 배양합니다. 다음날, 하룻밤 배양액의 1 내지 100 희석액 2밀리리터를 준비하고 카나마이신을 LB 200밀리리터에 접종합니다. 배양액을 섭씨 37도 및 200rpm에서 2.5-3시간 동안 또는 600나노미터의 광학 밀도가 0.9에서 1 사이에 도달할 때까지 배양합니다.

다음으로, 재배양된 박테리아를 8000배의 중력과 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버리고 0.9% 멸균 생리 식염수 100밀리리터로 박테리아를 부드럽게 교반하여 세척합니다. 세척 후 박테리아 배양액을 다시 원심분리하고 상청액을 부드럽게 버립니다.

그런 다음 0.9% 멸균 생리 식염수를 사용하여 펠릿을 100배 농축합니다.