바이러스 입자 생산을 위한 Borrelia burgdorferi 배양의 준비 및 유도

병원성 박테리아인 Borrelia burgdorferi의 유전자 변형 균주 배양으로 시작하십시오.

이 균주는 항생제 내성을 부여하는 표적 유전자를 포함하도록 조작된 게놈에 통합된 휴면 박테리오파지 DNA를 운반합니다.

해당 항생제를 첨가하고 배양액을 배양합니다. 항생제 내성 유전자는 항생제를 억제하는 단백질을 발현하여 유전자를 보유한 박테리아만 증식하도록 합니다.

배양액이 원하는 밀도에 도달하면 세포를 원심분리하여 펠릿화하고 상청액을 버립니다.

펠릿을 재현탁하고 화학적 유도제를 도입한 후 배양하여 DNA 손상을 유도합니다.

결과적인 DNA 복구 반응은 박테리오파지 DNA를 절제하여 복제, 구조 단백질의 발현 및 항생제 내성 유전자를 운반하는 새로운 비리온의 조립을 시작합니다.

배양액을 다시 원심분리하고 상청액을 버리고 세포를 신선한 배지에 재현탁합니다.

성숙한 비리온을 포함하는 박테리아 세포는 추가 다운스트림 적용을 위한 준비가 되어 있습니다.

형질도입 프로토콜을 위해 150마이크로리터의 적절한 보렐리아 부르그도르페리 클론을 단단히 캡이 있는 멸균 원추형 원심분리기 튜브에 15밀리리터의 BSK에 접종합니다. 그런 다음 Borrelia burgdorferi 클론 내에서 이종 DNA의 선택 및 유지를 위해 적절한 농도의 항생제 또는 항생제 조합으로 배지를 보충하고 샘플을 섭씨 33도에서 배양합니다. 배양액이 성장한 후, 적당량의 배양액을 6,000G에서 10분간 원심분리한다.

상청액을 디캔팅한 후 펠릿을 신선한 BSK에서 4밀리리터로 재현탁하고 샘플을 최소한의 헤드 공간으로 샘플을 고정할 수 있는 가장 작은 멸균 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 4밀리리터의 배양량을 기준으로 권장 농도에 적절한 양의 유도제를 첨가하여 파지 생성을 유도하고 튜브를 단단히 덮고 완전히 혼합합니다. 샘플을 섭씨 33도에서 2-4시간 동안 배양합니다.

그런 다음 샘플을 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 샘플을 6,000G에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅한 후 세포 펠릿을 15밀리리터의 BSK에 재현탁합니다.