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1. 군집 분석 배지 준비 및 접종<ol><li>미디어 준비 메모: 아래에 설명된 배지 조성은 녹농균 덩굴손 형성 연구에 적용할 수 있습니다. 녹농균, Bacillus subtilis 및 Myxococcus xanthus 표면 운동성 분석에 대한 표 1의 배지 사양을 참조하십시오.<ol style='list-style-type:decimal;'><li>유동화 호기성 바이오 반응기(FAB)-마이너스 황산암모늄((NH4)2SO4) 스웜 배지(재료표) 200ml, 귀천 0.9g, 카사미노산 0.2g(표 1)을 마그네틱 교반 바로 교반하여 혼합합니다. 실험 간의 일관성을 개선하기 위해 소량(100-300ml)을 사용하십시오.</li><li>22분의 노출 시간, 121.1°C의 노출 온도 및 빠른 벤트 옵션을 사용하여 200ml 한천/배지 혼합물을 오토클레이브합니다. 오토클레이브 설정은 적절한 살균 및 한천 용융을 허용하지만 한천 캐러멜화는 방지합니다. 메모: 고귀한 한천은 캐러멜화되기 쉽습니다. 박테리아 운동성은 캐러멜화된 한천에서 변경됩니다.</li><li>멸균 주기가 완료된 직후 증발로 인한 수분 손실을 방지하기 위해 미디어 병의 뚜껑을 닫으십시오. 그러나 뚜껑을 꽉 채우면 병에 "진공 밀봉"과 같은 효과가 발생할 수 있습니다.</li><li>실온(RT)에서 교반하면서 배지를 50°C로 냉각하고 멸균 1.2M 포도당 2ml를 첨가합니다. 또는 배지를 사용할 준비가 될 때까지(최대 15시간 후) 60°C 인큐베이터 또는 수조에 넣고 지시에 따라 진행합니다. 매체에 기포가 형성되는 것을 방지하려면 마그네틱 교반 막대를 사용하여 완전히 혼합하십시오. 한천 표면의 거품은 떼를 지어 버리는 것을 방지합니다. 메모: 다른 분석의 경우, 필요에 따라 이 단계에서 추가 영양소 또는 염료와 같이 고압멸균할 수 없는 열에 민감한 성분을 추가합니다(예: 아래 대표 결과에 표시된 바와 같이, 녹인 한천 100ml당 8μl Invitrogen Syto 63 염료를 이미지화합니다). 일부 염료의 첨가는 기본 군집 행동에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 염료가 아닌 대조군과 비교하여 확인해야 합니다.</li><li>실험실 후드에서 직경 60mm의 폴리스티렌 페트리 접시당 멸균 배지 7.5ml를 분취하고 플레이트를 단일 층(쌓지 않음)으로 유지합니다. 더 큰 떼 표면의 경우 직경 100mm 페트리 접시 당 25ml의 배지를 분취합니다. 균일한 수평면에 접시를 채우는 것이 중요합니다. 과녁 수준기를 사용하여 표면이 수평인지 확인합니다. 메모: P. aeruginosa(녹농균 ) 분석의 경우 플레이트당 특정 배지 부피를 사용하면 일관성과 재현성이 향상됩니다. B. subtilis 및 M. xanthus 분석의 경우, 손으로 붓는 것은 특정 부피의 분취량에 필적하는 결과를 산출합니다.</li></ol></li><li>플레이트 경화<ol style='list-style-type:decimal;'><li>작은 플레이트(60mm)의 경우, 녹은 한천 배지를 덮지 않은(즉, 뚜껑 없이) 후드에서 경화시키고(반고체 및 건조된 과도한 액체로 설정) 30분 동안 합니다. 더 큰 플레이트(100mm)는 더 긴 경화 시간이 필요합니다(설명 참조). 메모: 또는 일부 분석에서는 플레이트가 단일 층으로 덮여 있는(즉, 뚜껑을 덮은) 벤치 탑에서 밤새 (20-24시간) 경화해야 할 수 있습니다(표 1). 떼를 지어 보는 것은 과잉 수분과 불충분한 수분 모두에 민감합니다. 특정 실험실의 습도, 공기 흐름 및 온도에 따라 박테리아의 최적 떼를 촉진하기 위해 플레이트 경화의 변화가 필요할 수 있습니다.</li><li>건조 기간이 끝난 직후 플레이트에 접종하십시오. 추가 사용을 위해 플레이트를 보관하지 마십시오.<ol style='list-style-type:decimal;'><li>0.50%(vol/vol) Higgins 방수 블랙 인디아 잉크와 박테리아 접종물의 10μl 혼합물로 테스트 플레이트를 발견하여 "잉크 확산 테스트"를 수행합니다. 잉크/접종물 혼합물이 미디어 표면에 쉽게 퍼지면(즉, 물방울 형태를 유지하지 않음) 미디어가 건조되는 데 추가 시간이 필요합니다. 메모: 습도에 특히 민감한 종(예: 녹농균)의 경우 빠른 "잉크 확산 테스트"를 수행하여 플레이트가 충분히 건조한지 확인합니다.</li></ol></li></ol></li><li>군집 분석 접종<ol style='list-style-type:decimal;'><li>6ml의 국물 배양 배지(자세한 내용은 표 1 참조)에 신선한(실온에 방치하면 < 5일) 용해 원리 국물(LB) 플레이트 배양액에서 분리된 콜로니를 접종합니다. 국물 배양액을 30°C 또는 37°C에서 수평 진압(240rpm)과 함께 밤새도록 배양합니다(≤18시간).</li><li>1-5μl의 하룻밤 국물 배양액으로 스팟팅하거나 멸균 이쑤시개 또는 와이어 접종 바늘로 한천을 "찌르는" 방식으로 군집 플레이트를 접종합니다. 메모: 우리는 접종물이 튀를 가능성을 줄이고 군집 표면적에 추가 수분을 추가하는 것을 방지하기 때문에 후자의 방법을 선호합니다.</li></ol></li><li>군집 분석 배양<ol style='list-style-type:decimal;'><li>일반 분석의 경우, 군집 분석 플레이트를 30°C 또는 37°C( 또는 B. subtilis의 경우 42°C; 표 1) - 이것은 박테리아 특이적입니다. 과도한 수분이 한천이 아닌 뚜껑에 응축되도록 배양하는 동안 플레이트를 뒤집습니다. 메모: 온도는 표현형과 동역학에 영향을 미칠 수 있습니다. P. aeruginosa 떼의 경우 37°C에서 배양하면 30°C에서 배양하는 것보다 더 빠른 성장과 무리 확장이 가능합니다. 그러나 이러한 떼의 형태는 이러한 온도 변화에 따라 달라지는 경우가 많습니다.</li><li>타임랩스 이미징의 경우, 스웜 플레이트를 이미징 스테이션으로 옮기기 전에 적절한 온도에서 인큐베이팅합니다(자세한 내용은 표 1 참조). 메모: 이 사전 이미징 인큐베이션을 통해 떼는 새로운 환경으로 이동하기 전에 발달을 시작하고 자리를 잡을 수 있으며, 이는 떼 운동성에 최적일 수도 있고 아닐 수도 있습니다.</li></ol></li></ol>2. 표면 운동성 분석의 거시적 이미징<ol><li>타임랩스 이미징의 경우, 사전 이미징 배양 기간 후에 군집 분석 플레이트를 상업용 생체 내 이미징 스테이션 내부의 투명 이미징 플레이트에 놓습니다. 한 번에 최대 6개의 직경 60mm 또는 4개의 직경 100mm 플레이트를 이미지화합니다. 카메라는 이미징 평면 아래에서 이미지를 캡처하므로 광학 경로가 차단되지 않도록 플레이트를 반전시킵니다. 또는 실험 기간 동안 30°C 또는 37°C(표 1)에서 배양하고 설정된 시간 간격으로 인큐베이터에서 이미지화할 플레이트를 제거합니다.</li><li>페트리 접시의 뚜껑을 접종된 배지를 담는 접시 위에 똑바로 세웁니다. 이미징 중 과도한 건조를 방지하기 위해 페트리 접시의 뚜껑에 물을 채우고 실험 내내 습도를 유지하기 위해 다른 투명 트레이를 사용하여 전체 설정을 동봉합니다.</li><li>분자 이미징(MI) 소프트웨어를 사용하여 표 2에 설명된 이미징 설정을 사용하여 실온에서 분석을 실행합니다. 타임랩스 이미징의 경우 필요한 단계와 사양으로 프로토콜을 설정합니다.</li></ol>표 1: 표면 운동성 분석 준비 사양. P. aeruginosa, B. subtilis 및 M. xanthus에 대한 표면 운동성 분석 준비 사양이 포함되어 있습니다.<figure class='table' style='float:left;width:100%;'><table class='ck-table-resized'><colgroup><col style='width:20.02%;'><col style='width:20.02%;'><col style='width:20.79%;'><col style='width:19.14%;'><col style='width:20.03%;'></colgroup><tbody><tr><td> </td><td>녹농균</td><td>P. aeruginosa: 덩굴손 형성 연구</td><td>B. 서브틸리스</td><td>M. 크산투스</td></tr><tr><td>하룻밤 국물 배양 배지</td><td>FAB 플러스 30 mM 포도당</td><td>FAB 플러스 30 mM 포도당</td><td>파운드</td><td>CTT(복합 매체)</td></tr><tr><td>하룻밤 국물 배양 배양 온도</td><td>37 °C</td><td>37 °C</td><td>37 °C</td><td>30°C에서 30시간</td></tr><tr><td>스웜 미디어</td><td>팹</td><td>FAB 마이너스(NH4)2SO4</td><td>2%(중량/부피) LB</td><td>CTT</td></tr><tr><td>스웜 미디어: 추가 구성 요소</td><td>12 mM 포도당a</td><td>10%(wt/vol) 카사미노산(CAA), 12mM 포도당a</td><td>해당 사항 없음</td><td>SYTO® 64a</td></tr><tr><td>한천 유형</td><td>한천, 고귀한</td><td>한천, 고귀한</td><td>과립 한천</td><td>한천, 고귀한 Affymetrix</td></tr><tr><td>한천 농도(wt/vol)</td><td>0.45%</td><td>0.45%</td><td>0.60%</td><td>1.50%</td></tr><tr><td>군집 플레이트 크기</td><td>60 밀리미터</td><td>60 밀리미터</td><td>100 밀리미터</td><td>150 밀리미터</td></tr><tr><td>플레이트당 용지 부피</td><td>7.5 ml</td><td>7.5 ml</td><td>손으로 부은</td><td>손으로 부은</td></tr><tr><td>군집 배지 설정/건조 방법</td><td>두건; 덮이지 않은 판</td><td>두건; 덮이지 않은 판</td><td>벤치탑 플레이트 덮개</td><td>벤치탑 플레이트 덮개</td></tr><tr><td>스웜 미디어 설정/건조 시간</td><td>30 분</td><td>30 분</td><td>하룻밤(20 -24시간)</td><td>하룻밤(20 -24시간)</td></tr><tr><td>군집 분석 배양 온도</td><td>30 또는 37 °C</td><td>30 °C</td><td>37 °C</td><td>30 °C</td></tr><tr><td>타임랩스 이미징을 위한 인큐베이션</td><td>30°C에서 최소 4시간 동안</td><td>30°C에서 최소 4시간 동안</td><td>37°C에서 2시간 동안</td><td>12시간 동안 RT</td></tr><tr><td>타임랩스 캡처 길이</td><td>24 시간</td><td>24 시간</td><td>10 시간</td><td>66시간</td></tr><tr><td>타임랩스 설정</td><td>1 프레임/10 분</td><td>1 프레임/10 분</td><td>1 프레임/6 분</td><td>1 프레임/10 분</td></tr><tr><td colspan='3'>a 고압멸균 후 추가됨.</td><td> </td><td> </td></tr></tbody></table></figure> 표 2: 이미징 사양. 박테리아 표면 성장의 적색 및 녹색 형광 및 발광 이미징을 위한 Bruker 이미징 스테이션 사양.<figure class='table' style='float:left;'><table class='ck-table-resized'><colgroup><col style='width:20%;'><col style='width:20%;'><col style='width:20%;'><col style='width:20%;'><col style='width:20%;'></colgroup><tbody><tr><td>신호</td><td>녹색 형광</td><td>적색 형광 I</td><td>적색 형광 II</td><td>발광</td></tr><tr><td>단백질 또는 염료</td><td>녹색 형광 단백질(GFP)</td><td>mCherry 단백질 또는 나일 레드 람놀지질 염색</td><td>시토® 64</td><td> 럭스 오페론의 루시페라제</td></tr><tr><td>여기 파장(nm)</td><td>480 ± 10</td><td>540 ± 10</td><td>590 ± 10</td><td>꺼짐</td></tr><tr><td>방출 파장(nm)</td><td>535 ± 17.5</td><td>600 ± 17.5</td><td>670 ± 17.5</td><td>필터 없음</td></tr><tr><td>노출 시간(초)</td><td>30</td><td>60</td><td>60</td><td>240</td></tr><tr><td>F-스톱</td><td>4.0</td><td>4.0</td><td>2.5</td><td>1.1</td></tr><tr><td>FOV(mm)</td><td>190</td><td>190</td><td>140</td><td>120</td></tr><tr><td>초점면(mm)</td><td>27.5</td><td>27.5</td><td>12.2</td><td>4</td></tr><tr><td>비닝(픽셀)</td><td>없음</td><td>2 x 2</td><td>없음</td><td>8 x 8</td></tr></tbody></table></figure>

<figure class='table'><table class='ck-table-resized'><colgroup><col style='width:20%;'><col style='width:20%;'><col style='width:20%;'><col style='width:20%;'><col style='width:20%;'></colgroup><tbody><tr><td>시약:</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>FAB 최소 미디어:</td><td> </td><td> </td><td> </td><td>~4주마다 준비하십시오. 나노퓨어 H2O로 1L까지 토핑합니다.</td></tr><tr><td>(NH4)2소4</td><td>시그마</td><td>A4418</td><td>2 그램</td><td>P. aeruginosa, 덩굴손 형성 연구에는 사용되지 않습니다.</td></tr><tr><td>Na2HPO4 x 7H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9390</td><td>9 그램</td><td> </td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>시그마</td><td>P5655</td><td>3 g</td><td> </td></tr><tr><td>나크롬</td><td>BDH</td><td>BDH8014</td><td>3 g</td><td> </td></tr><tr><td>MgCl2 x 6H2O 용액(198g/L)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>M33</td><td>1ml</td><td> </td></tr><tr><td>CaCl2 x 2H2O 용액(14g/L)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>C79</td><td>1ml</td><td> </td></tr><tr><td>미량 금속 용액(아래 참조)</td><td>해당 사항 없음</td><td>해당 사항 없음</td><td>1ml</td><td> </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>미량 금속 용액:</td><td> </td><td> </td><td> </td><td>나노퓨어 H2O로 1L에 담아 유리병에 담아 저어주고 호일로 덮습니다.</td></tr><tr><td>CaSO4 x 2H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>255548</td><td>200 mg</td><td> </td></tr><tr><td>MnSO4 x H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>M7634</td><td>20 mg</td><td> </td></tr><tr><td>CuSO4 x 5H2O</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>C493</td><td>20 mg</td><td> </td></tr><tr><td>아연소4 x 7H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z4750 시리즈</td><td>20 mg</td><td> </td></tr><tr><td>코소4 x 7H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>C6768</td><td>10 mg</td><td> </td></tr><tr><td>나무오4 x 2H2O</td><td>시그마</td><td>S6646</td><td>10 mg</td><td> </td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>답74</td><td>5 mg</td><td> </td></tr><tr><td>FeSO4 x 7H2O</td><td>시그마-알드리치</td><td>F7002 시리즈</td><td>200 mg</td><td> </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>CTT 미디어:</td><td> </td><td> </td><td> </td><td>필요에 따라 준비하십시오. 나노퓨어 H2O로 100ml에 얹습니다.</td></tr><tr><td>Tris-HCl, 1 M 용액(pH 8.0으로 조정)</td><td>암레스코</td><td>234</td><td>1ml</td><td>나노 순수 H2O에 1M 원액을 준비하고 pH를 8.0으로 조정하고 여과하여 멸균합니다(0.2μm 기공).</td></tr><tr><td>K2HPO4, 1 M 용액(pH 7.6으로 조정)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3786</td><td>0.1 ml</td><td>나노 순수 H2O에 1M 원액을 준비하고 pH를 7.6으로 조정하고 여과하여 멸균합니다(0.2μm 기공).</td></tr><tr><td>MgSO4 용액</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>M65</td><td>0.8 ml</td><td>나노 순수 H2O에 1M 원액을 준비하고 필터 멸균(0.2μm 기공)합니다.</td></tr><tr><td>카시톤</td><td>BD 진단</td><td>225930</td><td>1 그램</td><td> </td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>추가 시약:</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>LB 육수, 레녹스</td><td>BD 진단</td><td>240230</td><td>2 % (중량/부피)</td><td> </td></tr><tr><td>D-(+)-포도당</td><td>시그마-알드리치</td><td>지5767</td><td>하룻밤 국물 배양의 경우 30mM; 스웜 미디어의 경우 12mM</td><td>나노 순수 H2O에서 1.2M 필터 멸균 원액을 준비하고 고압멸균 후 배지에 첨가합니다.</td></tr><tr><td>카사미노산(CAA)</td><td>암레스코</td><td>J851</td><td>0.10 % (중량 / 볼륨)</td><td>P. aeruginosa, 덩굴손 형성 연구에 권장됩니다. 고압멸균 전에 배지에 첨가하십시오.</td></tr><tr><td>한천, 고귀한</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5431</td><td>0.45 % (중량 / 부피)</td><td>P. aeruginosa의 표면 운동성 연구를 위한 선호되는 Noble 한천. 고압멸균 전에 배지에 첨가하십시오.</td></tr><tr><td>한천, 고귀한</td><td>아피메트릭스</td><td>10907</td><td>1.50 % (중량/부피)</td><td>M. xanthus 표면 운동성 연구에 사용됩니다. P. aeruginosa의 운동성 연구에는 권장되지 않습니다. 고압멸균 전에 배지에 첨가하십시오.</td></tr><tr><td>한천, 과립</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP1423 시리즈</td><td>0.60 % (중량/볼륨)</td><td> </td></tr><tr><td>히긴스 방수 블랙 인디아 잉크</td><td>히긴스</td><td>HIG44201</td><td>0.50 % (부피/부피)</td><td>잉크와 접종물을 혼합하여 스웜 미디어 표면 수분을 테스트합니다.</td></tr><tr><td>SYTO® 64 적색 형광 핵산 염색</td><td>인비트로젠</td><td>S-11346</td><td> </td><td>용융 한천 100ml당 SYTO® 64 4μl(P . aeruginosa의 경우) 또는 8μl( M. xanthus의 경우)(고압멸균 후 첨가)를 사용합니다.</td></tr><tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>관련 자재 및 장비:</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>페트리 접시, 멸균, 150 mm x 15 mm (Dia.x H)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>페트리 접시, 멸균, 100 mm x 15 mm (Dia.x H)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>페트리 접시, 멸균, 60 mm x 15 mm (Dia.x H)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td> </td><td> </td></tr><tr><td>생체 내 Xtream</td><td>브루커</td><td> </td><td> </td><td>표면 운동성 연구의 거시적 이미징에 사용됩니다. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html</td></tr></tbody></table></figure>

박테리아 표면 운동성을 시각화하기 위한 군집 분석

출처: <a href='https://app.jove.com/v/52338/preparation-imaging-quantification-bacterial-surface-motility'>Morales-Soto, N. et. al., 박테리아 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화. J. Vis. 경험. (2015년)</a>이 비디오는 연질 한천의 표면 운동성을 관찰하기 위해 녹색 형광 단백질을 발현하는 박테리아를 사용하는 군집 분석을 보여줍니다. 타임랩스 이미징은 조정된 팽창과 덩굴손 형성을 포착하여 박테리아 표면 운동성을 강조합니다.

Source: Morales-Soto, N. et. al., Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (2015)This video ...

녹색 형광 단백질을 발현하는 운동성 박테리아가 들어 있는 튜브로 시작합니다.바늘을 사용하여 박테리아를 부드러운 영양 한천 플레이트에 배치하여 박테리아 표면 운동성을 연구합니다.다음으로 한천 표면에 물이 결로되는 것을 방지하기 위해 플레이트를 뒤집습니다.박테리아가 자랄 수 있도록 플레이트를 배양합니다.배양이 진행됨에 따라 박테리아는 편모를 사용하여 접종 지점에서 바깥쪽으로 이동을 시작합니다.배양이 완료되면 뚜껑을 열고 한천 면이 광학 검출기를 향하도록 거꾸로 된 플레이트를 이미징 시스템에 넣어 정확한 이미징을 보장합니다.물이 채워진 뚜껑을 접시 위에 놓습니다. 습한 환경을 유지하기 위해 밀봉하십시오.이미징 시스템을 닫고 타임랩스 이미지 획득을 시작합니다.시간이 지남에 따라 박테리아 이동은 덩굴손이라고 하는 녹색 손가락 모양의 돌출부를 생성합니다. 이러한 박테리아 구조는 중앙 접종 지점에서 바깥쪽으로 확장되어 박테리아 표면 운동성을 확인합니다.박테리아 균주에 따라 멸균 이쑤시개 또는 와이어 접종 바늘로 한천 표면을 찔러 건조된 군집 한천 플레이트 위에 1-5마이크로리터의 하룻밤 배양물을 접종하고, 군집 분석 플레이트를 섭씨 30도, 섭씨 37도 또는 섭씨 42도로 설정된 인큐베이터로 옮깁니다. 과도한 수분이 한천이 아닌 플레이트 뚜껑에 응축되도록 플레이트를 뒤집고, 타임랩스 이미징 직전에 균주별 온도에서 2시간 또는 4시간 동안 박테리아를 평형화합니다.다음으로, 한천 표면의 박테리아가 장치의 거꾸로 된 카메라를 향하도록 플레이트를 생체 내 이미징 장치로 옮깁니다. 모든 페트리 접시 뚜껑에 소량의 물을 채웁니다. 그런 다음 거꾸로 된 한천 플레이트 위에 물가가 위를 향하도록 각 뚜껑을 놓습니다.이미징 장치 내부에서, 이미징 인클로저를 밀봉하여 일정한 습도 수준을 유지하고, 이미징 장치의 이미징 설정을 조정하고, 스워밍 활동의 타임랩스 이미징을 시작합니다. 실시간 이미징 후 박테리아의 군집 역학은 Image J와 같은 표준 이미지 분석을 사용하여 분석할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiology

미생물학

Bacterial Growth and Techniques

세균 성장 및 실험 기법

Cultivation and Growth Techniques

재배 및 성장 기술

Swarming Assay for Visualizing Bacterial Surface Motility

이 프로토콜은 차별적으로 구별되는 Vibrio parahaemolyticus 헤모글로빈 과 swarmer 세포의 단일 세포 현미경 검사를 가능하게합니다. 이 방법은 단일 세포 분석을 위해 쉽게 얻을 수있는 덩어리 세포 집단을 생산하고 세포 배양의 준비, 스웜머 분화의 유도, 샘플 준비 및 이미지 분석을 다루고있다.

세포 분화 및 단일 세포 이미징의 유도 비브리오 균 (Vibrio parahaemolyticus) Swimmer and Swarmer Cells

여기에서, 우리는 박테리아 떼 운동성을 평가하면서 동시에 다중 농도 반응을 얻기 위해 유도제 구배 플레이트의 사용을 설명합니다.

유도기 그라디언트 플레이트의 박테리아 표면 떼 운동성 정량화

여기에서는 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성을 감지하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 평가하기 쉽고 정확하며 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다.

색상 반응을 기반으로 한 박테리아 운동성 시각화

출처: Chu, W. 및 Zhuang, X. 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성 시각화. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 운동성 균주와 비운동성 균주를 시각적으로 구별하여 박테리아 운동성을 평가하기 위한 산화환원 염료 기반 반고체 한천 분석을 보여줍니다.

산화환원 염료 보충 반고체 배지를 사용한 박테리아 운동성 시각화

출처: Scheidweiler, D. 외. 유체 장치와 현미경 및 유동 세포분석을 결합하여 공간적 규모를 넘어 다공성 배지 내 미생물 수송을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 무작위로 배열된 기둥들로 구성된 다공성 매트릭스를 통해 박테리아의 운동성을 정량화하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 형광 표지된 박테리아를 장치에 투입하고, 다공성 매트릭스를 통과해 관찰 채널로 이동하는 동안 현미경으로 영상화한 후 분석하여 돌파 곡선(BTC)을 생성합니다.

마이크로플루이딕 장치를 이용한 박테리아 운동성 평가

군집 운동성은 물리적, 환경적 요인의 영향을 받습니다. 우리는 군집 분석 준비 및 데이터 수집과 일반적으로 관련된 문제를 우회하기 위한 2단계 프로토콜과 지침을 설명합니다. 현재의 분석 기술로는 제공되지 않는 떼 행동에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 거시적 이미징 기술이 사용됩니다.

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

진화 시나리오되지만 (공간적 분리)의 역할은 공간 분포의 조정을 허용하는 제어 실험실에서 미생물 단순한 시스템을 사용하여 조사 할 수있다. 설립자 셀 밀도를 수정하여, 다양한 구색 수준은 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis)의 식민지 바이오 필름에 형광 표지 된 박테리아 균주를 사용하여 시각화 할 수 있습니다.

표면 식민지 미생물 집단에 공간 분리를 모니터링

최근의 연구 결과에 따르면 박테리아 편모 모터는 다양한 환경 신호를 감지하고 이에 반응하여 리모델링을 합니다. 여기에서 논의된 비드 분석은 환경 스트레스 요인에 대한 세포 적응에서 리모델링의 역할을 설명하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.

편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

우리는 평판 문서 스캐너를 사용하여 박테리오파지 (phage) 및 항생제 스트레스에 반응하는 슈도모나스 aeruginosa 떼의 고해상도 타임 랩스 영화를 생산하는 간단한 방법을 자세히 설명합니다. 이 절차는 무리 역학을 감시하기 위한 빠르고 간단한 방법이고 그밖 세균성 종의 운동성과 성장을 공부하기 위하여 적응될 수 있습니다.

세균성 떼의 시간 경과 이미징 및 집단 스트레스 반응

많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

배우세요 세균 표면 운동성을 시각화하는 군집 분석 방법을 통해 미생물 역학을 연구하세요. 형광 단백질을 이용한 타임랩스 이미징으로 세균 이동 패턴과 텐드릴 형성을 관찰할 수 있습니다.