Streptomyces의 발달 돌연변이를 평가하기 위한 위상차 현미경

사상질 토양 박테리아인 Streptomyces coelicolor의 야생형 및 돌연변이 균주 콜로니를 포함하는 한천 플레이트로 시작합니다.

콜로니 표면 위로 확장되는 필라멘트인 공중 필라멘트가 명확하게 보이는 조밀한 콜로니 성장 영역 위에 멸균 커버슬립을 놓습니다.

커버슬립을 부드럽게 눌러 공중 필라멘트 및 관련 포자를 커버슬립 표면으로 옮깁니다.

다음으로, 마운팅 미디어가 있는 현미경 슬라이드를 가져와 커버슬립 셀을 아래로 향하게 하여 박테리아 구조를 보존합니다.

슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 커버슬립에 침지 오일 한 방울을 추가한 다음 대물렌즈를 정렬합니다.

위상차 현미경을 사용하여 야생형 및 돌연변이 균주 모두에서 공중 필라멘트의 이미지를 획득합니다.

야생형 필라멘트는 균일한 크기의 규칙적인 간격의 포자를 나타냅니다.

대조적으로, 돌연변이 균주는 부풀어 오른 필라멘트, 불규칙한 포자 또는 용해된 포자와 같은 결함을 나타내며 야생형과 돌연변이 사이의 발달 표현형 차이를 드러냅니다.

박테리아 성장의 커버슬립 리프트를 준비하려면 멸균 핀셋을 사용하여 멸균 커버슬립을 집어 들고 박테리아 성장이 조밀한 MS 한천 플레이트에 커버슬립을 놓습니다. 핀셋을 사용하여 커버슬립 뒷면을 부드럽게 눌러 박테리아 포자와 공중 균사체가 충분히 전달되도록 합니다. 플레이트에서 커버슬립을 집어 들고 15마이크로리터의 50% 글리세롤 방울이 들어 있는 현미경 슬라이드 표면을 향하도록 세포 물질이 45도 각도로 놓습니다.

커버슬립이 기포를 줄이는 글리세롤에 떨어지도록 합니다. 다양한 시간 간격으로 위상차 현미경 검사를 수행하려면 준비된 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 커버슬립 중앙에 침지 오일 한 방울을 추가합니다. 100x 위상 대물렌즈를 제자리에 돌리고 콘덴서 터렛을 적절한 일치 위상 설정으로 설정합니다.

대물 렌즈가 오일에 닿으면 미세 조정 손잡이만 사용하여 이미지의 초점을 맞춥니다. 돌연변이 균주와 야생형 사이의 눈에 띄고 일관된 차이를 식별하기 위해 여러 시야를 조사합니다. 포자를 형성하는 능력, 포자 크기 및 모양, 포자의 전체 수 등.