에틸렌 방출 화합물을 이용한 에틸렌에 대한 박테리아 반응 조사

셀룰로오스 생성 박테리아가 사전 접종된 성장 배지가 들어 있는 멀티웰 플레이트로 시작합니다.

처리된 웰에서 배지에는 2-클로로에틸포스폰산(CEPA)이 보충됩니다.

가스 교환을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하고 배양합니다.

배양하는 동안 CEPA는 기체 분자인 에틸렌을 가수분해하여 방출합니다.

에틸렌은 세포질 UDP-포도당을 활용하여 셀룰로오스를 합성하는 박테리아 셀룰로오스 합성효소를 활성화합니다.

시간이 지남에 따라 박테리아는 막을 통해 셀룰로오스를 압출합니다.

이것은 공기-액체 계면에서 박테리아의 자기 조립을 촉진하여 부유 셀룰로오스 기반 생물막 또는 펠리클을 형성합니다.

배양 후, 펠리클을 신선한 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 알칼리성 용액을 첨가하고 더 높은 온도에서 배양하여 세포를 용해합니다.

알칼리성 용액을 제거합니다. 셀룰로오스를 유지하면서 세포 파편을 제거하기 위해 교반하면서 반복적으로 세척합니다.

펠리클을 말리고 무게를 잰다. 대조군에 비해 CEPA 처리 샘플의 건조 중량이 높을수록 에틸렌에 대한 반응으로 박테리아 셀룰로오스 생산이 향상되었음을 나타냅니다.

펠리클 분석은 박테리아 셀룰로오스 생산을 위한 표준 분석 도구입니다. PH 및 형태학적 분석은 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 준비 시 스타터 배양에서 세포를 세 번 수확하고 Petroff-Hauser 계수 챔버를 사용하여 세포를 정량화합니다.

그런 다음 CEPA 농도가 다른 4개의 중간 마스터 믹스를 준비합니다. 각 마스터 믹스에 대해 pH 7 SH 배지 60밀리리터를 분취하고 0, 5, 50 또는 500밀리몰 CEPA 원액 120마이크로리터를 첨가하여 0, 0.01, 0.1 또는 1.0밀리몰의 최종 CEPA 농도를 얻습니다. 플라스크를 소용돌이쳐 이 매체를 혼합합니다.

각 삼중체에 대해 하나의 배지 세트가 필요하고 멸균 대조군으로 기능하려면 네 번째 세트가 필요합니다. 따라서 각 60밀리리터 배지 제제를 4개의 14밀리리터 분취량으로 나눕니다. 그런 다음 밀리리터당 100,000개 세포의 최종 농도를 위해 각각의 스타터 배양액을 접종하기 전에 14밀리리터 분취량을 미리 냉각합니다.

셀룰로오스 생성을 방지하기 위해 접종된 모든 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 나머지 14밀리리터 분취량은 멸균 대조 웰에 사용하십시오. 이제 각 14밀리리터 마스터 믹스에서 2밀리리터 분취량을 멸균 24웰 플레이트의 6웰에 로드하여 분석된 스타터 배양액당 총 4개의 로드된 플레이트를 로드합니다.

플레이트를 파라핀 필름으로 조심스럽게 밀봉하고 섭씨 30도에서 7일 동안 정적으로 배양합니다. 접시에서 펠리클을 수집하려면 펠리클의 한쪽을 눌러 반대쪽 가장자리를 들어 올리고 집게로 집습니다.

다음으로, 펠리클을 6웰 플레이트의 웰에 개별적으로 옮깁니다. 섭씨 80도에서 12밀리리터의 0.1 정상 수산화나트륨으로 20분 동안 처리하여 세포를 용해시킵니다. 그런 다음 수산화나트륨을 제거하고 처리된 펠리클을 12밀리리터의 초순수로 6웰 플레이트에서 교반하면서 24시간 동안 철저히 세척하여 중화합니다.

이 부화 기간 동안 6시간마다 물을 갈아주세요. 부화가 끝나면 펠리클은 흰색이어야 합니다. 그런 다음 펠리클을 실리콘 매트 위에 놓고 섭씨 50도에서 48시간 동안 건조시켜 건조 중량 측정을 준비합니다.