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미생물학
0 조회수 • 2:41 분 • September 26th, 2025
박테리아 펠릿으로 시작하십시오. 박테리아는 개시제 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하지만 항생제 내성 유전자가 부족합니다.
세포 분해를 최소화하기 위해 펠릿을 차가운 물에 재현탁합니다.
항생제 내성 유전자와 표적 유전자를 운반하는 플라스미드를 섭취하십시오. 이 플라스미드는 개시제 단백질 없이는 복제할 수 없기 때문에 자살 플라스미드라고 합니다.
박테리아 현탁액에 플라스미드를 첨가합니다.
현탁액을 차갑게 식힌 큐벳으로 옮깁니다.
박테리아 막을 일시적으로 파괴하는 고전압 펄스를 적용하여 플라스미드가 들어갈 수 있도록 하여 전기천공을 시작합니다.
회수 배지를 추가하고 혼합물을 배양 튜브로 옮깁니다.
흔들면서 배양합니다.
항생제가 들어 있는 한천 플레이트를 가져다가 배양액을 플레이트합니다.
박테리아 개시제 단백질은 복제 기점에 결합하여 플라스미드가 항생제 내성 단백질을 복제하고 발현할 수 있도록 합니다.
이를 통해 플라스미드를 가진 박테리아가 생존하고 성장하여 플라스미드 증폭을 촉진할 수 있습니다.
5, 000배 G 및 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리하여 박테리아 배양을 펠릿화합니다. 펠릿을 차가운 증류수에 현탁하고 세척 과정을 두 번 더 반복합니다.
박테리아 현탁액을 마이크로 분리 튜브로 옮기고 14, 000배 G 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리를 반복합니다. 펠릿을 차가운 물에 재현탁한 후 약 3.5마이크로리터의 결찰 혼합물을 첨가하고 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 내용물을 냉각된 2mm 갭 전기천공 큐벳으로 옮깁니다.
전기천공 후 SOC 배지를 첨가하고 내용물을 배양 튜브로 옮깁니다. 섭씨 30도에서 200RPM으로 흔들어 1시간 동안 배양합니다. 클로람페니콜이 보충된 LB 한천 플레이트에 형질전환된 세포를 플레이트합니다.