게놈 트랜스포존 삽입을 통한 그람 음성 박테리아의 분리

짝짓기 기증자와 수혜자 그람 음성 박테리아 집단의 냉동 배양액을 얼음 위에서 해동하는 것으로 시작합니다.

수용 세포는 항생제 카나마이신에 대한 내성 유전자를 포함하는 짧은 DNA 세그먼트인 트랜스포존을 운반합니다. 이러한 트랜스포존은 숙주 게놈에 무작위로 통합됩니다.

카나마이신을 함유하지만 기증자 특이적 영양소가 없는 영양이 풍부한 한천 플레이트에 배양액을 첨가하십시오.

멸균 비드를 추가하고 플레이트를 부드럽게 회전시켜 배양액을 균일하게 퍼뜨립니다.

구슬을 제거하고 배양합니다. 수용 박테리아는 영양분을 활용하지만 트랜스포존이 통합된 박테리아만이 카나마이신에 저항하여 콜로니 형성을 유도합니다.

트랜스포존이 없는 기증자와 수혜자 박테리아는 성장하지 못합니다.

콜로니 형성 단위를 계산하여 고유한 트랜스포존 삽입이 있는 수용자 박테리아의 수를 추정합니다.

신선한 배지를 추가하고 박테리아 개체군을 수집합니다.

원심분리하여 박테리아를 펠릿화하고 상청액을 버립니다.

박테리아 생존력을 보존하기 위해 동결 보호제가 포함된 배지에 펠릿을 재현탁합니다.

얼음 위에서 얼린 짝짓기의 분취량을 해동합니다. 그런 다음 멸균 유리 구슬을 사용하여 150마이크로리터의 희석액을 카나마이신이 보충된 각 30 x 150mm Luria-Bertani 한천 플레이트에 펴 바릅니다.

과도한 짝짓기가 포함된 사용한 튜브를 폐기하고 플레이트를 섭씨 37도에서 14시간 동안 배양합니다. 배양 후 각 플레이트에서 콜로니 형성 단위를 계산하여 트랜스포존 라이브러리의 총 돌연변이를 추정합니다. 최소 3개의 플레이트의 20%를 계산하여 전체 플레이트 그룹에 대한 콜로니 수 추정치를 결정합니다.

예상 콜로니 수확량을 계산한 후 각 플레이트에 LB 3-5밀리리터를 추가하고 멸균 스크래핑 도구를 사용하여 박테리아를 긁어냅니다. 모든 플레이트에서 박테리아 현탁액을 50밀리리터 원뿔형 튜브로 당기고 5, 000배 G에서 7분 동안 원심분리하여 현탁액을 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 30% 글리세롤을 보충한 LB 5밀리리터에 펠릿을 다시 현탁합니다.

그런 다음 트랜스포존 라이브러리의 1밀리리터 분취량을 냉동 바이알에 만들어 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.