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미생물학
0 조회수 • 2:29 분 • September 26th, 2025
미리 성장한 RNA 간섭 또는 RNAi 발현 박테리아가 들어 있는 플레이트로 시작합니다.
이 박테리아는 항생제 내성 유전자를 포함하는 플라스미드와 숙주에서 특정 유전자 발현을 억제하기 위해 이중 가닥 RNA 또는 dsRNA를 생성하는 표적 유전자 삽입물을 운반합니다.
멸균 핀을 사용하여 콜로니를 항생제 보충 배지가 들어 있는 딥웰 플레이트로 옮깁니다.
깊은 우물이 통기를 제공하는 균일한 박테리아 성장을 위해 쉐이킹과 함께 플레이트를 배양합니다.
항생제는 플라스미드가 부족한 박테리아를 제거하여 플라스미드를 함유한 박테리아만 생존하도록 합니다.
플레이트를 원심분리하여 박테리아를 분리하고 상청액을 버립니다.
박테리아를 완충된 식염수에 재현탁시켜 안정화시킵니다.
재현탁된 박테리아를 항생제와 유도제가 모두 보충된 영양이 풍부한 배지가 들어 있는 멀티웰 플레이트에 분배합니다.
항생제는 플라스미드 함유 박테리아를 선택하는 반면 유도제는 dsRNA 발현을 유발합니다.
RNAi 발현 박테리아가 시딩된 플레이트는 추가 분석을 위한 준비가 되었습니다.
24웰 딥웰 플레이트의 단일 웰에서 여러 RNAi 박테리아 균주를 병렬로 테스트하기 위해, 이전에 제조된 박테리아를 함유하는 RNAi의 각 클론으로부터 단일 콜로니를 4밀리리터의 카르베니실린 보충 LB에 접종한다. 플레이트를 섭씨 37도 및 950rpm에서 멀티웰 플레이트에 최적화된 진탕 인큐베이터에 16시간 동안 넣고, 그런 다음 2,000g에서 5분 동안 원심분리하여 박테리아를 수집합니다. 플레이트를 뒤집고 세게 흔들어 상청액을 디캔팅합니다.
100마이크로리터의 S Basal을 사용하여 RNAi 박테리아를 재현탁합니다. 재현탁된 박테리아를 IPTG와 카르베니실린이 보충된 멀티웰 NGM 플레이트의 적절한 수의 웰에 피펫팅하고 플레이트를 건조시킵니다.