Name: 의 거대한 섬유 패스에서 Electrophysiological 레코딩 D. melanogaster /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster의 거대한 섬유 시스템에서 시냅스 전달을 전기생리학적으로 기록하는 방법을. DLM과 TTM 근육의 흥분후 전위를 측정하여 신경 회로의 기능적 특성을 평가할 수 있습니다.

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1. 장비 및 재료 <ol><li> 이러한 실험 자극기, 자극 격리 장치 두 microelectrode 앰프, 데이터 수집 시스템 및 수집 소프트웨어를 컴퓨터로 구성된 표준 전기 생리학 설정을 사용합니다. 추가 장비는 패러데이 케이지, 붐 스탠드에 stereomicroscope, 진동 절연 테이블, 광원 및 녹음 플랫폼을 포함합니다. </li><li> 다섯 micromanipulators이 사용됩니다. 다른 세 micromanipulators는 두 자극 전극과 접지 전극을 위치로 총 컨트롤을 필요로하는 동안 두 micromanipulators은 기록 전극을 위치에 대한 미세 제어를 필요로합니다. DLM 기록 전극에 대한 micromanipulator은 준비의 꼬리 끝에 배치됩니다 (실험자의 왼쪽)과 TTM 기록 전극에 대한 micromanipulator은 준비의 실험자와 사이드 (약간 실험자의 왼쪽에있는) 사이에 배치됩니다. 시뮬레이션 전극을 개최합니다 두 micromanipulators은 준비의 머리 (오른쪽 실험자의)에 배치됩니다. 접지 전극에 대한 micromanipulator은 준비의 반대편에 위치 </li><li> MΩ 40-60의 resistances와 유리 녹음 microelectrodes를 당기면 왁스 지원 접시에 평평하게 보관합니다. 자극에 대한 두 electrolytically (NaOH) 둘레에 텅스텐 전극이 사용됩니다. 텅스텐 와이어, 나 다른 공급 electrolytically 가공 전극은​​ 접지로 사용됩니다. 자극 및 접지 전극은 준비하고 micromanipulators에 연결된 실험 세션의 시작하기 전에 및 세션의 기간 동안 교체하지 않아도됩니다. </li></ol> 2. D. 준비 melanogaster <ol><li> 장비가 설정되면, 그것은 파리를 준비하는 시간이야. 그들에 얼음을 냉각하거나 CO 2를 사용하여 파리를 마취. CO 2를 사용하는 경우 다음 실험을 시작하기 전에 깨어나기 가스의 효과에 대한 충분한 시간을 (20mins에 대해) 수 있습니다. </li><li> 약 45 °의 각도로 sloped 소프트 왁스의 플랫폼을 포함하는 요리 자신의 다리로 부드럽게 파리를 전송하는 집게를 사용하십시오. 다음 4 단계 (하지만 주변) 녹음 장비 멀리 해부 현미경으로 이루어집니다. </li><li> 다음 단계는 왁스의 비행을 확보하는 것입니다. 경사면의 앞쪽에 직면 위쪽과 아래쪽 동양의 파리 복부 측면. 좋은 포셉 한 켤레를 사용하면, 쌍, 다리의 바깥쪽을 연장하고, 밀랍으로 그들을 밀어. </li><li> 지느러미 세로 근육이나 DLM 및 tergotrochanteral 근육, 또는 TTM :에서 기록하는 근육의 위치를​​ 맡은지. DLMs의 subcuticular 첨부 파일 사이트는 흉부 정중선과 앞쪽에 지느러미 (또는 setae) bristles 사이의 영역과 일치합니다. TTM 첨부 파일 사이트는 뒷부분과 앞쪽에 위에 - 날개가 bristles의 dorsally 있습니다. 날개, DLM 또는 TTM 섬유에 대한 액세스를 방해 바깥쪽 날개를 잡고 '접착제'그들 왁스로되지 않도록 제작. </li><li> 포셉의 벌금 쌍을 사용하여 바깥쪽으로 조심스럽게 코를 끌어와 밀랍으로 그것을 immersing하여 보안. 이것은 코가 부드럽고 쉽게 머리의 나머지 부분에서 분리되기 때문에 연습을 요구하는 중요한 단계입니다. 그렇게되면, 파리를 버리고 다시 시작. 눈을 통해 자극 전극을 삽입 때이 방법으로 머리를 보호하지 않으면 문제가 발생합니다. </li></ol> 3. 전극 배치 <ol><li> 비행이 왁스로 고정되면, 패러데이 케이지 안에있는 stereomicroscope 아래 첨부된 플라이로 요리를 전송합니다. 동양은 실험자의 오른쪽에있는 비행의 머리를 옆으로 날아. </li><li> 다음 단계는 전극을 삽입하는 것입니다. 지상과 자극 전극은 현미경으로 보지 않고 삽입하실 수 있습니다. 좋은 음반은 정확한 뽑에 의존, 그것은 micromanipulators 처리 연습하는 것이 좋습니다 그럼. 자신의 적절한 배치와 후속 녹음을 촉진하기 위하여 micromanipulators의 도움으로 삽입의 사이트에 가까운 전극을 가져와. </li><li> micromanipulator에 조정 바퀴를 사용하여 복부의 뒷부분 끝에 접지 전극을 낮추십시오. 두뇌에 날카롭게 자극 텅스텐 전극을 삽입하려면 그냥 파리의 눈 중 하나를 만지는 때문에 전극 중 하나의 팁을 위치로 micromanipulator를 사용합니다. 두 전극 막 각 눈의 바깥쪽을 건드리는거야 그래서 다른과 동일한 작업을 수행. 다음 전극을 눌러, 차례로 각각의 눈을 통해 전극의 도움말을 머리 캡슐의 뒷면 (2-3밀리미터 정도)에 위치한 두뇌를 도달. </li><li> 올바르게 배치 전극은 거대한 섬유 시스템을 활성화합니다. 자극 전극이 올바르게 배치되었는지 테스트하려면, 30-60의 짧은 (0.03 MS) 자극을 적용자극 전극, 그리고 비행 / 다리 근육의 날개 기라도의 움직임을 찾아 건너 V ' </li><li> 다음 단계는 해밀턴 또는 열을 뽑아 플라스틱 주사기를 사용하는 3M KCl과 유리 microelectrodes 다시 - 작성 및 미세 제어 micromanipulators에 그들을 배치하는 것입니다. 제대로 삽입 microelectrodes는 실험의 여러 라운드에 사용될 수 있습니다. </li><li> 첫번째 기록 전극은 DLM 섬유에 삽입됩니다. 이 양자 대칭 DLMs가있다, 각 6 각 근육 섬유로 구성되어 있습니다. 녹음은 여섯 섬유의에서 수행할 수 있지만, 가장 일반적으로 사용되는 DLM 섬유 흉부 표피의 지느러미 측면을 통해 좋은 접근으로 인해 45A 및 45B, 그리고 두 섬유가 같은 motorneuron에 의해 innervated있다는 사실 아르 . </li><li> 당신에게서 멀리 떨어져 측면에 micromanipulator를 사용하여, DLM 섬유 45A 또는 B.에 기록 전극을 삽입 플랫폼의 경사가 DLM 전극 삽입을 에이즈 ~ 60-90 각도에서 지느러미 표피를 입력할 수 있습니다. 오실로 스코프 모드에서 소프트웨어를 사용하여 흉부에 기록 전극을 삽입하는 동안 컴퓨터 모니터보세요. 전극은 근육을 입력했을 때 기준이 근처 제로 또는 마이너스 값을 드롭합니다. 당신은 근육 반응을 관찰할 수 있는지에 대한 하나의 자극과 함께 테스트합니다. </li><li> 당신에게 가장 가까운 TTM에 다른 기록 전극을 삽입합니다. 이 전극은 근육 첨부 파일 사이트의 위치로 인해, 당신의 앞에, 옆으로 삽입됩니다. 추적은 전극이 근육에 표시되면 하나의 자극이하고 테스트를하는 동안 다시 모니터를 관찰합니다. </li></ol> 4. 자극 및 녹음 <ol><li> 이제 다리와 비행 근육에서 두뇌와 녹음 답변을 자극 시작할 준비가 된 것입니다. (컴퓨터 모니터에 관찰로 즉 근육 트위치, 그리고 근육 세포 탈분극)는 응답을 관찰하기 전까지 30 V에서 시작 60 V로 증가 자극 전극에 걸쳐 짧은 (0.03 MS) 자극을 적용합니다. 실험의 나머지 부분은 응답 임계값 위의 전압 5-10 V를 설정합니다. </li><li> 응답 지연 시간을 측정하려면 각 자극 사이에 오초 휴식 기간 최소 5 단일 자극을 제공합니다. </li><li> 서로 다른 속도로 자극의 기차를 제공하여 "다음 중 주파수"를 확인합니다. 일반적으로 열 자극 10 열차는 200Hz (각 자극 사이 5ms)와 300Hz는 (각 자극 사이 3ms), 100Hz (각 자극 사이 10ms)에 부여됩니다. 자극의 각 열차 사이 이초의 휴식 기간을 허용합니다. </li></ol> 5. 결과 : 거대한 섬유 패스에 다음과 같은 응답 대기 시간 및 빈도 <ol><li> 응답 지연 시간은 두뇌의 자극과 근육의 탈분극 사이의 시간입니다. 이 그림은 하나의 자극에 DLM과 TTM에 대한 응답 대기 시간을 비교합니다. 0.7 및 GF - DLM 경로에 대한 GF - TTM 경로 및 1.3 1.7 MS 사이에 1.2 MS 사이의 대기 시간은 건강한 준비와 적절한 레코딩 기술을 나타냅니다. 대기는 유전자형, 유전자 배경, 온도와 나이가 다를 수 있습니다. 두뇌에 적용되는 하나의 자극 아래 TTMs과 DLMs에서 기록된 응답을 보여주는 그림 1 (A와 B). 대표 흔적. </li><li> 여기로 표시된 TTM에서 녹음 진폭과 대형 DLM 섬유의 사람들에게 비해 postsynaptic 잠재적인 (PSP)의 형태 측면에서 많은 변화를 보여,이 증가 변화는 TTM 근육 섬유의 작은 크기로 인해합니다. 이 변화는 그러나, 거대한 섬유 - 투 - TTM 경로에 대한 응답 지연 값에 영향을주지 않습니다. TTM와 DLM 모두 4 개인 파리에서 그림 1 (C와 D). 자세한 '응답 지연 시간'흔적. PSP 모양의 TTM의 흔적 전시 변화 참고하지만, 응답 지연 시간은 영향을받지 않습니다. DLM을위한 PSP 모양의 적은 변화가 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="그림 1 A-D" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1 - D"> </li><li> 각각의 자극 주파수에서 DLM과 TTM 경로 모두에 대해 성공적인 응답 (10 밖으로)의 비율을 계산하여 100 Hz에서 200 Hz에서, 300 Hz에서에서 "다음 중 주파수"를 비교합니다. 100 Hz에서에서 TTM과 DLM 모두 자극 1시 1분를 따르십시오. 이 interneurons 사이의 중간 화학 버렸네가 자극 사이에 복구할 수있는 충분한 시간이 없기 때문에 100 Hz에서 위의 자극 주파수에서 DLM 응답은 오류를 표시 시작합니다. TTM 답변 그러나, 심지어는 300Hz 이상의 자극과 1시 1분 남아 있습니다. 그림 2. 녹음 "다음 중 주파수"를 보여주는 대표 흔적. 100Hz에서 모두 TTMs 및 DLMs 모든 열 자극 (왼쪽)에 대응. 200Hz에서 DLM 응답은 (별표) 실패 시작합니다. <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> </li></ol>6. 대표 결과 와일드 타입 짧은 대기 시간 반응 (자극 전극은 감각 수용체를 무시하고 직접 GF 회로를 실​​행, 눈 상태에 놓이게됩니다) 0.7 및 GF - TTM 경로에 대한 1.2 MS 사이 유전자형, 유전자 배경, 온도 및 연령 및 범위에 따라 GF - DLM 경로에 대해 1.3 and1.7 MS (Tanouye 및 와이먼, 1980, 토마스 및 와이먼, 1984, 엥겔 및 우, 1992, 알렌과 머피, 2007; 펠란 외, 2008;. 오거 스틴 외, 게시되지 않은.) . 이것은 매우 짧은 TTM 지연 때문에 경로의 disynaptic 자연뿐만 아니라 화학 버렸네 (PSI - DLMn)의 존재의 monosynaptic 경로와 긴 대기 시간 DLM의 강력한 GF - TTMn 전기 버렸네 때문입니다 발생합니다. GF의 afferents의 활성화와 낮은 강도 자극을 사용하거나 시각 ( "빛을 해제") 신호를 제공함으로써 중 달성 아르에서 중급 및 장기 지연 반응 (&gt; 3 MS) 결과. 100Hz에서 TTM과 DLM 모두 자극 1시 1분을 따라야합니다. 100Hz 위 DLM 응답은 PSI와 DLMns 사이의 화학 버렸네가 떨어져 10ms 미만의 자극 사이에 복구하는 충분한 시간을 없다처럼 실패를 표시하기 시작합니다. TTM 응답 그러나, 심지어는 300Hz (; 엥겔 및 우, 1992;. 앨런 외, 2007;. 마르티네즈 외, 2007 Tanouye 및 와이먼, 1980) 이상의 자극과 1시 1분 유지됩니다. GF - DLM 분기 응답하는 동안 Drosophila 간격 교차로 채널 ( "innexin")를 인코딩 shakB 유전자에 돌연변이, 크게 GF - TTM 경로 (~ 1.5 MS)의 응답 대기 시간을 증가 (알렌과 머피, 2007; 펠란 외., 2008). 돌연변이 응답이 지연 효과가 중단 신경근육학 전송으로 인해 아니라는 것을 보여주는 직접 흉부 신경을 자극하여 복원할 수 있습니다. 고주파 자극을 수행하는 능력 또한 야생 입력 GF - DLM 및 GF - TTM 경로는 보통 각각 100 Hz에서 300 Hz에서에 1시 1분 비율 10 자극을 수행하실 수 있습니다 어디에 파리에 비해 이러한 mutants에서 장애인입니다. 이러한 주파수는 상당히 지속적인 비행 (30-10 Hz에서) (Hummon와 코스텔로, 1989) 동안 계약 근육에 의해받은 정상적인 자극 주파수 위에됩니다하는 것이 중요합니다. GFS 출력의 안정성을 설명하는 데 사용되는 다른 매개 변수는 "불응기"또는 아직도 근육 두 응답을 생산 트윈 자극 펄스 사이의 최소 시간입니다. 내화 시간 TTMs 및 DLMs에 대한 7-15 MS에 대해 1-4 사이의 MS를 따라 다릅니다. DLMs에 대한 비교적 긴 내화물 기간은 상대적으로 PSI - DLMn 접합 (Tanouye 및 와이먼, 1980에서 화학 시냅스를 불안 정한 예정이다, Gorczyca 및 홀, 1984, 엥겔 및 우, 1992; 바너지 외, 2004;. 앨런과 Godenschwege, 2010).

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

하나는 고품질의 녹음을 얻을하려고 할 때주의를 지불했다 가장 중요한 것들 중 하나는 준비의 적절한 오리 엔테이션과 건강입니다. 이상적으로, 파리는 여전히 전기 자극에 반응하는 레코딩 세션의 끝에 살아하고해야합니다. 에 기록 전극이 가장 효율적으로 흉부 외골격을 뚫고위한 전극과 직각을 이루는 등, 즉시 그러한 방식으로 표면에 붙어 있어야, 필요한 경우, 전극의 삽입은의 일부를 제거하여 용이 될 수있다 메스 텅스텐과 지느러미 흉부 표피 따라서 DLM 비행 근육 (이 단계는 어렵게 유리 전극의 도움말을 휴식하는 만들기의 추가 혜택을 제공합니다) 노출. 또한, 치료가 subcuticularly 위치 DLMs 및 TTMs을 통해 전극을 밀어 피하기 위해 이동해야합니다. 파리의 머리는 잘 제대로 두뇌에 삽입되도록 자극 전극 수 있도록하고이 레코딩 세션 동안 꺼내되는 것을 방지하기 위해 보안해야합니다. 의 크기와 잘 설명하는 형태로 인해 GFS는 Drosophila에서 가장 접근의 연결 경로 중 하나를 나타냅니다. 작은 분자량의 추적 염료로 전기 시냅스의 투자율은 전기 결합 뉴런의 시각화를위한 수 있으며, 여러 가능한 GAL4 라인은 가능한 셀 또는 셀 그룹 (제이콥스 외, 2000의 일부에서 유전자 발현 수준을 조작하게;. 앨런 외., 2006) Drosophila GFS의 연결을 소성을 공부에 편리한 모델 시스템 (엥겔 및 우 만들기 위에서 언급한 장점, 그러한 요법 이니, 자발적인 복구 및 dishabituation로 회로 디스플레이 등록 정보의 모두 수입 성의와 흉부 구성 요소 이외에도, 1996).

<table border="1"><tbody><tr><td> NAME </td><td> 회사 소개 </td><td> CAT. # </td><td> 의견 </td></tr><tr><td> S48 스퀘어 펄스 자극기 </td><td> 그라스 악기 </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 자극 장치 </td><td> 그라스 악기 </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> SIU5 RF 변압기 절연 유니트 </td><td> 그라스 악기 </td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 5A 2 채널 세포 Microelectrode 앰프 </td><td> 악기하기 </td><td></td><td> http://www.gettinginstruments.com/ </td></tr><tr><td> Digidata 1440A 데이터 수집 시스템 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> 아날로그 - 디지털 Digidata 1320 및 Axoscope 9.0 소프트웨어 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td> 수동 micromanipulators로 레코딩 플랫폼 </td><td> Narishige, 서터 기능., 세계 정밀 기능. </td><td></td><td> http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> 광원 </td><td> Fostec </td><td></td><td> http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm </td></tr><tr><td> 와일드 M5의 stereomicroscope </td><td> 와일드 Heerbrugg </td><td></td><td> http://www.wild-heerbrugg.com/ </td></tr><tr><td> 진동 절연 테이블 </td><td> TMC </td><td></td><td> http://www.techmfg.com/ </td></tr><tr><td> microelectrodes에 대한 Borosilicate 튜브 </td><td> 서터 악기 </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> P - 95 Micropipette 풀러 </td><td> 서터 악기 </td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> Microfil 34 게이지, 67mm (전극 필러) </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> MF34G - 5 </td><td> http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td> Microdissection 도구 (집게, ...) </td><td> 파인 과학 도구 </td><td></td><td> www.finescience.com </td></tr><tr><td> 해부 (스테레오) 현미경 </td><td> Leica </td><td></td><td> http://www.leica-microsystems.com/ </td></tr><tr><td> 패러데이 케이지 </td><td> 알 수없는 제조 업체 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 기타 : 플라스틱 주사기, 텅스텐 지구 와이어와 NaOH - 날카롭게 텅스텐 전극, KCl, 왁스 플랫폼, 모니터와 PC를 ...

의 거대한 섬유 패스에서 electrophysiological 레코딩 d. melanogaster</em

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

성인 놀라게하는 경우 D. melanogaster은 공중으로 점프하고 멀리 비행 반응. D. 등 많은 무척추 동물에서 성인 단계에서 melanogaster, &quot;탈출&quot;(또는 &quot;놀라게&quot;) 응답은 여러 구성 요소의 연결 회로 거대한 섬유 시스템 (GFS)라고하여 중재합니다. 뉴런, 그들 특유의 형태학 및 간단한 연결의 비교 대형 크기는 GFS의 연결 회로를 공부에 대한 매력적인 모델 시스템을 확인합니다. GFS의 경로는 그의 axons 자궁 결합을 통해 흉부 신경절에 정중선을 따라 머리에서 내려와이 양자 대칭 장 섬유 (GF) interneurons 구성되어 있습니다. 복부 신경 tergotrochanteral 근육 드라이브 ipsilateral motorneuron 1) 큰 중간 dendrite (TTMn) (TTM), mesothoracic 대퇴골 / 다리의 주요 신근와 GFS 양식 전기 화학 시냅스의 mesothoracic neuromere (T2)에서 하고, 2) contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) 어느 방향 양식에있는 등 지느러미 근육 길이 (DLMs)의 motorneurons (DLMns), 날개 depressors과 화학 (cholinergic) 시냅스. 그들은 날개에 직접 연결된 것이 아니라 이동하지 않습니다 - dorsovental 근육 (DVMs)으로의 연결 통로 (S), 날개 엘리베이터 아직 (DLMs와 DVMs가 간접 비행 근육으로 공동으로 알려져 있습니다 풀려되지 않았습니다 간접적으로 왜곡된 인근 흉부 표피에 의해 날개) (왕의 와이먼, 1980;. 앨런 외, 2006). DLMs의 디 - 시냅스 활성 (PSI를 통해)는 TTMs 먼저 대퇴골을 연장하여 추진 수 TTM의 monosynaptic 활성화 (~ 0.5 MS)에 상대 이러한 근육의 수축의 타이밍에 작지만 중요한 지연을 초래 지상에서 비행. 동시에 차례로 서로 비행 기간 동안 DVMs을 신장 활성화 DLMs을 스트레칭 활성화 TTMs. GF 경로는 감각 (예 : &quot;공기 퐁퐁&quot;또는 &quot;라이트 - 오프&quot;) 자극을 적용하여 중 간접적으로 활성화하거나 직접 두뇌 (여기서 설명)에 위에 - 임계값 전기 자극에 의​​해 수 있습니다. TTMns 및 DLMns 다른, 밝혀지지 않은, 감각 입력을하더라도 두 경우 모두에서, 행동의 가능성은 전적으로 GFS, PSIs 및 TTM / DLM motoneurons 통해 TTMs 및 DLMs 도달합니다. &quot;지연 반응&quot;(자극과 근육의 탈분극 사이의 시간)과 측정 (고주파 자극의 특정 숫자로 성공적인 응답의 숫자) &quot;고주파 자극에 다음과 같은 것은&quot;reproducibly 및 양적 기능 상태를 평가하는 방법을 제공한다 모두 중앙 시냅스 (GF - TTMn, GF - PSI, PSI - DLMn) 및 화학 (glutamatergic) 신경근육학 분기점 (TTMn - TTM 및 DLMn - DLM)을 포함하여 GFS 구성 요소의. 이것은 중앙 버렸네 형성에 관련된 유전자를 식별하고 CNS 기능을 평가하기 위해 사용되고 있습니다.

거대한 섬유 시스템은 성인의 간단한 회로의 연결입니다<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; 파리에서 가장 큰 신경을 포함하는. 우리는 거대한 섬유 interneurons의 직접적인 자극을 다음과 지느러미 길이 (DLM)와 tergotrochanteral (TTM) 근육에 게시 신경 잠재력을 기록하여이 경로를 통해 시냅스 전송을 감시하기위한 프로토콜을 설명합니다.

의 거대한 섬유 패스에서 Electrophysiological 레코딩 D. melanogaster</em

성체 *D. melanogaster*는 깜짝 놀랐을 때 공중으로 뛰어올라 날아가며 반응합니다. *D. melanogaster*를 포함한 많은 무척추동물 종에서 이러한 "탈출" ...

본 절차의 전반적인 목적은 거대 섬유 뉴런에 직접 자극을 가한 후, 등쪽 종근(dorsal longitudinal muscle, DLM)과 Togo tro cantoral 근육(TTM)에서 시냅스 후 전위를 기록함으로써 거대 섬유 경로를 통한 시냅스 전달을 모니터링하는 것입니다. 이를 위해 먼저 왁스가 약간 묻어 있는 접시에 마취된 초파리를 적절히 고정합니다. 다음 단계는 초파리에 자극 전극, 접지 전극 및 기록 전극을 삽입하는 것입니다.절차의 마지막 단계는 뇌를 자극하고 도약 및 비행 근육의 반응을 기록하는 것입니다. 궁극적으로 유전자형, 연령, 온도 등에 따른 거대 섬유 경로의 기능적 특성 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이는 자극과 반응 사이의 시간을 측정하고, 고주파 연속 자극 이후의 성공적인 반응 횟수를 계산함으로써 이루어집니다.이 방법은 신경생리학 분야의 몇 가지 핵심 질문을 해결하고 신경 경로의 기능적 특성을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 유전적 또는 분자 분석으로 이어지는 도입 실험으로 활용하거나, 알려진 돌연변이를 가진 동물의 생리학적 및 기능적 특성을 평가하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다.준비 및 손상 단계는 학습하는 데 어느 정도 시간이 소요됩니다. 초파리는 상대적으로 크기가 작기 때문에, 실험을 정확하게 수행하기 위해서는 일정 수준의 안정성과 협응력을 습득해야 합니다. 본 실험에서는 자극기, 자극 격리 장치, 두 개의 미세전극 증폭기, 데이터 수집 시스템, 그리고 수집 소프트웨어가 설치된 컴퓨터로 구성된 표준 전기생리학 설정 장치를 사용합니다.추가 장비로는 패러데이 케이지, 붐 스탠드가 장착된 실체 현미경, 진동 격리 테이블, 광원 및 기록 플랫폼이 포함됩니다. 5개의 마이크로 매니퓰레이터가 사용됩니다. 이 중 2개의 마이크로 매니퓰레이터는 기록 전극의 배치를 위해 정밀 제어 장치가 필요하며, 나머지 3개의 마이크로 매니퓰레이터는 거친 제어 장치만 있으면 됩니다.두 개의 자극 전극과 접지 전극을 배치하기 위해, DLM 기록 전극용 매니퓰레이터를 표본의 꼬리 쪽 끝에 배치합니다. TTM 기록 전극용 마이크로 매니퓰레이터는 실험자와 표본의 측면 사이에 배치합니다. 자극 전극용 마이크로 매니퓰레이터 두 개는 표본의 머리 쪽에 배치합니다.접지 전극용 마이크로 조작기를 표본 준비 구역의 반대편에 배치합니다. 저항이 40~60 MΩ인 유리 기록용 마이크로 전극을 뽑아 왁스로 고정된 접시에 평평하게 보관합니다. 자극을 위해서는 전자기적으로 연마된 텅스텐 전극 2개를 사용합니다.스템 와이어(stem wire) 또는 세 번째 전자기적으로 제작된 전극을 사용하십시오. 접지로 사용할 자극 전극과 접지 전극을 실험 세션 시작 전에 마이크로 조작기에 부착하십시오. 해당 전극들은 세션이 진행되는 동안 교체할 필요가 없습니다.장비 설정이 완료되면 파리를 준비합니다. 파리를 얼음 위에서 10~15분 동안 냉각시켜 마취시킵니다. 핀셋을 사용하여 파리의 다리 부분을 조심스럽게 잡아 약 45도 각도로 기울어진 소프트 왁스 플랫폼이 있는 접시로 옮깁니다.다음 단계는 파리를 왁스에 고정하는 것입니다. 파리의 배면이 아래로 향하게 하고 머리 부분이 경사면의 위쪽을 향하도록 배치하십시오. 미세 핀셋을 사용하여 다리를 쌍으로 바깥쪽으로 펴고 왁스 속으로 밀어 넣으십시오.본 실험을 시작하기 전, 기록 대상인 근육의 위치, 즉 배측 종근(dorsal longitudinal muscle, DLM)과 흉부 가로근(thoracic transverse muscle, TTM)의 위치를 숙지하십시오. DLM의 표피 부착 부위는 흉부 정중선과 전배측 강모 사이의 영역에 해당합니다. TTM 부착 부위는 후익상 및 전익상 강모의 배측에 위치합니다. 날개가 DLM 또는 TTM 섬유로의 접근을 방해하지 않도록 날개를 바깥쪽으로 펼쳐 왁스에 고정하십시오. 미세 핀셋을 사용하여 후측 가슴 가시(psis)를 조심스럽게 바깥쪽으로 당긴 후, 왁스에 담가 고정하십시오.proboscis는 부드러워 머리의 나머지 부분에서 쉽게 분리되므로 어느 정도의 연습이 필요한 매우 중요한 단계입니다. 분리된 경우, 해당 파리를 폐기하고 처음부터 다시 시작하십시오. 머리를 이 방식으로 고정하지 않으면 눈을 통해 자극 전극을 삽입할 때 문제가 발생합니다.초파리가 왁스에 고정되면, 준비물을 패러데이 케이지(faraday cage) 내부의 실체 현미경 아래에 놓습니다. 실험자를 기준으로 초파리의 머리가 오른쪽에 오도록 초파리를 옆으로 향하게 배치합니다. 다음 단계는 전극을 삽입하는 것입니다. 적절한 배치와 이후의 기록을 용이하게 하기 위해 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극을 삽입 부위 가까이 가져옵니다. 현미경을 통해 보지 않고, 마이크로 매니퓰레이터의 조절 휠을 사용하여 접지 전극을 복부의 후단으로 내린 다음, 끝을 뾰족하게 만든 텅스텐 자극 전극을 뇌에 배치합니다.마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 전극 하나 중 하나의 팁이 초파리의 한쪽 눈에 살짝 닿도록 위치시킵니다. 다른 전극에 대해서도 동일하게 수행하여, 두 전극이 각각 양쪽 눈의 외부에 살짝 닿게 합니다. 그런 다음 전극을 밀어 넣습니다.각 눈의 뒤쪽으로 약 2~3mm 정도 돌려 전극의 끝이 머리 캡슐 뒤쪽에 위치한 뇌에 닿게 합니다. 전극이 올바르게 배치되면 거대 섬유 시스템(giant fiber system)이 활성화되어 자극 전극의 배치 상태를 확인할 수 있습니다. 자극 전극에 30~60V의 짧은 자극을 가하고 날개의 움직임이나 비행 또는 다리 근육의 경련이 있는지 확인하십시오.다음 단계는 Hamilton 또는 열 인발 플라스틱 시린지를 사용하여 유리 미세 전극에 3 M KCl을 채운 후, 이를 정밀 제어 마이크로 매니퓰레이터에 장착하는 것입니다. 적절하게 삽입된 미세 전극은 여러 차례의 실험에 반복해서 사용할 수 있습니다. 첫 번째 기록 전극은 DLM 섬유에 삽입합니다.양측 대칭인 두 개의 dlm이 존재합니다. 각각은 6개의 개별 근섬유로 구성되어 있습니다. 6개의 섬유 중 어느 곳에서나 기록이 가능하지만, 흉부 큐티클의 등쪽을 통해 접근성이 좋고 두 섬유 모두 동일한 운동 뉴런에 의해 지배된다는 점 때문에 DLM 섬유 45 A와 45 B가 가장 일반적으로 사용됩니다.프레퍼레이션 인서터(preparation inserter)의 꼬리 부분에 배치된 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여, 파리에서 가장 먼 쪽의 DLM 섬유 45 A 또는 B에 기록 전극을 삽입합니다. 플랫폼의 경사를 통해 DLM 전극이 등쪽 큐티클에 60~90도 각도로 진입할 수 있으며, 이는 오실로스코프 모드 소프트웨어를 사용한 관통을 용이하게 합니다. 기록 전극을 흉부로 삽입하는 동안 컴퓨터 모니터를 확인하십시오.전극이 근육에 진입하면 기선(baseline)이 0에 가깝거나 음수 값으로 떨어집니다. 단일 자극을 통해 근육 반응이 관찰되는지 확인하십시오. 다른 기록 전극을 실험자에게 가장 가까운 쪽의 초파리 TTM에 삽입하십시오. 근육 부착 부위의 위치 때문에 이 전극은 실험자 정면 방향으로 측면에서 삽입합니다.이 과정에서도 계속해서 모니터를 관찰하십시오. 트레이스가 전극이 근육 내에 위치함을 나타내면, 단일 자극을 주어 근육 반응을 유도합니다. 뇌에 자극을 주고 다리 및 비행 근육의 반응을 기록하기 시작하려면, 자극 전극에 0.03 millisecond 자극을 가합니다. 전압은 30 volts에서 시작하여 컴퓨터 모니터에 근육 수축과 근육 세포 탈분극이 관찰될 때까지 60 volts까지 높입니다.실험의 나머지 과정 동안, 전압을 반응 임계값보다 5~10V 높게 설정하십시오. 반응 잠복기를 측정하려면, 각 자극 사이에 5초의 휴지기를 두어 최소 5회의 단일 자극을 주십시오.다양한 빈도의 자극 열(trains of stimuli)을 제공하여 추종 빈도(frequency of following)를 결정합니다. 일반적으로 100 hertz, 200 hertz, 300 hertz에서 10개의 자극으로 구성된 자극 열을 10회 제공하며, 각 자극 열 사이에는 2초의 휴지기를 둡니다. 이 그림은 뇌에 단일 자극을 준 후 TTM 및 dlm에서 기록된 반응을 보여줍니다.반응 잠복기는 뇌 자극과 근육의 탈분극 사이의 시간입니다. G-F-T-T-M 경로의 경우 0.7에서 1.2 milliseconds 사이, GF DLM 경로의 경우 1.2에서 1.7 milliseconds 사이의 잠복기가 나타나면 표본 준비 상태가 양호하고 기록 기술이 적절한 것으로 판단됩니다. 잠복기는 여기에 표시된 바와 같이 유전자형, 유전적 배경, 온도 및 연령에 따라 달라질 수 있습니다.TTM에서 측정된 기록은 거대 DLM 섬유에서 측정된 기록에 비해 시냅스 후 전위의 진폭과 형태 면에서 더 많은 가변성을 보입니다. 이러한 가변성의 증가는 TTM 근섬유의 크기가 작기 때문에 발생합니다. 그러나 이러한 가변성은 거대 섬유에서 TTM으로 이어지는 경로의 반응 잠복기 값에는 영향을 미치지 않습니다.이 그림은 100 Hz 및 200 Hz에서 TTM과 DLM의 자극을 보여줍니다. TTM과 DLM 모두 200 Hz의 모든 10회 자극에 반응합니다. TTM 반응은 일대일로 유지되지만, DLM 반응은 실패하기 시작합니다.100 hertz 이상의 자극 주파수에서 DLM이 추종하지 못하는 이유는 두 개의 중간 뉴런 사이의 중간 화학적 시냅스가 자극 사이에 회복될 충분한 시간을 갖지 못하기 때문입니다. 숙련되면 이 기술은 약 30분 내에 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 거대 섬유 경로를 통해 신경전달을 모니터링하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이는 뇌의 뉴런으로 이어지는 거대 섬유를 자극한 다음, 흉부의 도약근과 비행근에서 기록함으로써 수행됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기 Drosophila의 유충의 신경근육학 교차점에서 시냅스 전송을 측정 electrophysiological 방법을 설명합니다. Evoked 릴리스는 모터 신경의 axons을 자극하여 인공적으로 시작되며, NMJ을 통해 전송은 근육에 evoked postsynaptic 반응에 의해 측정할 수 있습니다.

Drosophila의 애벌레의 NMJ에서 시냅틱 후보를 녹음 Electrophysiological 방법

에 Electrophysiological 녹음 Drosophila 엠브료

성인 전체 마운트 준비 Drosophila</em장 섬유 염료 주입을위한> 복부 신경 코드

를 사용하여 화합물 Bioactivity위한 이점 Nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템

이 비디오는 초파리 유충의 중추신경계(CNS)에서 신경 세포 활동을 세포 외로 기록하는 것을 보여줍니다. transection된 CNS는 기록 챔버에 배치되고 하행 신경의 전기 활동을 기록하여 기준선 발사 빈도를 설정합니다. 그런 다음 테스트 에이전트를 도입하고 발사 빈도의 변화를 기록하여 에이전트의 흥분 또는 억제 효과를 결정합니다.

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에서 전기 생리학 기록<em&gt; 초파리</em&gt; Labellar는 Sensilla 맛

Sharp microelectrodes는 살아있는 초파리에서 광수용체 및 시각 중간뉴런 출력의 정확한 전기생리학적 특성을 가능하게 합니다. 여기에서는 이 방법을 사용하여 제어된 광 자극에 대한 개별 셀의 고품질 전압 응답을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 곤충 겹눈의 신경 정보 처리를 연구하는 데 이상적입니다.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

시 냅 스 전류 초파리 3 탈피 애벌레 neuromuscular 접속점에 시각화 된 시 냅 스 boutons에서 focally 기록 될 수 있습니다. 이 기술은 단일 시 냅 시스 bouton의 활동을 모니터링 수 있습니다.

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이 프로토콜 비용 효율적이 고 편리한 약리학 대리인, 신경 단백질의 유전자 돌연변이의 테스트를 가능 하 게 초파리 melanogaster 중앙 신경 시스템의 하강 전기 활동을 기록 하는 방법을 설명 합니다. 또는 미개척된 생리 적인 통로의 역할입니다.

제 3-탈피 초파리 Melanogaster 의 중앙 신 경계 활동의 electrophysiological 녹음

이 프로토콜은 온전한 Drosophila 유충에서 개별 뉴런의 레이저 세포 절제를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 발달 중인 신경계에서 뉴런 간의 경쟁을 줄이는 효과를 연구할 수 있습니다.

온전한 Drosophila 유충의 레이저 세포 절제는 시냅스 경쟁을 보여줍니다.

학습하세요 Drosophila melanogaster의 거대한 섬유 시스템에서 시냅스 전달을 전기생리학적으로 기록하는 방법을. DLM과 TTM 근육의 흥분후 전위를 측정하여 신경 회로의 기능적 특성을 평가할 수 있습니다.

의 거대한 섬유 패스에서 Electrophysiological 레코딩 D. melanogaster

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