음의 이온 교환 크로마토그래피에 의한 박테리아 단백질의 선택적 정제

JoVE Encyclopedia of Experiments

미생물학

0 조회수 • 3:28 분 • October 30th, 2025

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선택적 단백질 결합을 위해 양전하를 띤 작용기를 포함하는 이온 교환 수지 용액으로 시작합니다.

다음으로, 병원성 박테리아인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)의 독성 인자를 과발현하도록 조작된 숙주 박테리아 세포에서 얻은 단백질 추출물을 섭취합니다.

추출물은 pH 8의 완충액에 숙주 세포 단백질과 함께 표적 독성 인자를 포함합니다.

단백질 추출물을 수지와 혼합하고 교반하면서 배양하여 균일한 단백질-수지 상호 작용을 보장합니다.

완충액 pH보다 낮은 등전점을 갖는 숙주 단백질은 음전하를 띠고 양전하를 띤 수지에 결합합니다.

완충액 pH에 가까운 등전점을 갖는 표적 단백질은 대부분 전하를 띠지 않고 결합되지 않은 상태로 유지됩니다.

단백질-수지 슬러리를 크로마토그래피 컬럼으로 옮기고 수지가 침전되도록 합니다.

결합되지 않은 표적 단백질을 포함하는 액상을 수집합니다.

표적 단백질의 최대 회수율을 보장하기 위해 완충액으로 수지를 헹굽니다.

DEAE 수지 15밀리리터를 제조하려면 0.6g의 DEAE 수지 건조 분말을 30밀리리터의 Tris-HCl 완충액에 실온에서 최소 하루 동안 현탁시킵니다.

수지를 섭씨 4도에서 10,000배g에서 1분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 버린다. 그런 다음 15밀리리터의 Tris-HCl 완충액을 추가합니다. 원심분리, 재현탁 단계를 4회 더 반복한 후 침전된 수지 15밀리리터를 섭씨 4도에서 보관하여 후속 사용을 위해 보관합니다.

섭씨 4도에서 작업하면서 준비된 수용성 단백질 45밀리리터를 수지 15밀리리터에 넣고 교반 막대가 있는 100밀리리터 비커에 옮깁니다. 섭씨 4도에서 교반판을 사용하여 단백질 수지 슬러리를 1시간 동안 저어줍니다. 다음으로, 단백질 수지 슬러리를 마개가 장착된 플라스틱 또는 유리 기둥에 붓고 수지가 중력 하에 가라앉도록 합니다.

스톱콕을 열어 컬럼의 액체 레벨이 레진 바로 위에 올 때까지 단백질 용액이 중력 흐름에 의해 컬럼을 통과하도록 합니다. 정제된 호중구 활성화 단백질을 포함하는 결합되지 않은 분획으로 흐름을 수집합니다. 얼음처럼 차가운 Tris-HCl 완충액 15밀리리터를 컬럼에 추가합니다.

마개를 다시 열어 컬럼의 액체 레벨이 수지 바로 위에 올 때까지 세척 완충액이 중력 흐름에 의해 컬럼을 통과하도록 합니다. 흐름을 세척 분율로 수집합니다. 얼음처럼 차가운 완충액으로 세척을 4회 더 반복하여 추가 세척 분획을 수집합니다.

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마지막 업데이트: 15 8월 2026