Streptococcus mutans에서 폴리히스티딘 태그 단백질을 정제하는 절차

배지에 분비된 폴리히스티딘 태그 단백질을 발현하는 Streptococcus mutans 의 배양을 취하십시오.

배양액을 원심분리하고 단백질이 풍부한 상청액을 수집합니다.

황산암모늄을 첨가하고 교반하면서 배양하여 용해도를 감소시켜 단백질을 침전시킵니다.

용액을 튜브로 옮기고 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.

단백질을 안정화시키기 위해 염과 낮은 이미다졸을 함유한 결합 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

과도한 염분을 제거하기 위해 신선한 결합 완충액에 대해 용액을 투석합니다.

투석된 용액을 원심분리하여 불용성 파편을 펠릿화한 다음 상청액을 여과합니다.

여과액을 니켈 하전 친화성 수지와 혼합하고 배양하여 폴리히스티딘 태그 단백질이 니켈 이온에 선택적으로 결합할 수 있도록 합니다.

혼합물을 크로마토그래피 컬럼에 로드하고 결합 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.

다음으로, 이미다졸이 높은 용출 완충액을 첨가하여 니켈 이온에서 히스티딘을 대체하고 폴리히스티딘 태그가 부착된 단백질을 방출합니다.

정제된 단백질을 포함하는 이 용출액을 수집합니다.

박테리아 배양 현탁액을 섭씨 4도에서 10,000배 g에서 20분 동안 원심분리합니다.

배양 상층액을 3리터 유리 비커에 옮깁니다. 배양 상청액의 단백질을 농축하려면 2리터 상청액을 마그네틱 교반기에 놓고 격렬하게 교반하기 시작합니다. 황산암모늄 1,122g을 첨가하고 섭씨 4도에서 4시간 동안 또는 밤새 세게 저어주면서 침전물이 형성되도록 합니다.

다음으로, 황산암모늄 침전 용액을 섭씨 4도에서 20분 동안 15,000배 g으로 원심분리합니다. 상청액을 디캔팅합니다. 주걱으로 침전물을 모아 200밀리리터 유리 비커에 옮깁니다.

펠릿을 35밀리리터의 결합 완충액에 재현탁합니다. 그런 다음 각각 약 25밀리리터의 현탁액을 재생된 셀룰로오스 투석 튜브로 옮깁니다. 투석 튜브를 섭씨 4도의 교반기에 있는 교반 결합 완충액 2.5리터에 넣어 현탁액을 투석합니다.

2시간 후에 투석액을 교체하고 밤새 투석을 계속합니다. 다음으로, 투석된 현탁액을 튜브에서 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브를 섭씨 4도에서 10분 동안 20,000배 g의 원심분리기에 넣습니다. 흡입 여과 장비를 사용하여 상청액을 0.2마이크로미터 멤브레인 필터 위에 부어 여과합니다.

여과액을 75밀리리터 플라스크로 옮깁니다.

여과된 현탁액에서 폴리히스티딘 태그가 부착된 gtfSI를 분획하려면 먼저 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 준비합니다. 원고에 따라 수지를 평형화한 후 호프만 핀치 콕을 닫습니다.

여과된 현탁액 5밀리리터를 컬럼에 첨가하여 슬러리를 만듭니다. 그런 다음 모든 슬러리를 나머지 여과된 현탁액으로 옮기고 혼합물을 섭씨 4도에서 30분 동안 부드럽게 휘젓습니다. 혼합물을 컬럼에 다시 넣습니다.

Hoffman 핀치 콕을 열어 중력 흐름에 의해 서스펜션을 제거합니다. IMAC 수지를 20밀리리터의 결합 완충액으로 세척한 다음 20밀리리터의 용출 완충액을 용리하여 재조합 gtfSI를 얻습니다.