급속 평형 투석법을 통한 결핵 병변으로부터 카제움에 대한 약물 결합 측정

결핵 병변에서 나오는 괴사되고 지질이 풍부한 물질인 카제움의 균질한 현탁액을 섭취하는데, 이 물질은 그 중심에 약물 내성 마이코박테리아를 품고 있습니다.

균질액과 와류에 시험 약물을 첨가하여 카제움 매트릭스와의 상호 작용을 촉진합니다.

반투막으로 분리된 급속 평형 투석 인서트 함유 기증자 및 수신기 챔버를 베이스 플레이트에 놓습니다.

약물 스파이크 균질을 기증자 챔버에 로드하고 수용기 챔버에 완충액을 추가합니다.

플레이트를 밀봉하고 회전하면서 배양합니다.

배양하는 동안 유리 약물은 막을 가로질러 확산되어 두 챔버 사이의 평형에 도달합니다.

평형에 도달하면 기증자 샘플을 완충액으로 희석하고 수신기 샘플을 약물이 없는 균질염으로 희석하여 약물 정량화를 위한 매트릭스 조건을 정규화합니다.

마지막으로 약물 농도를 정량화하고 결합되지 않은 약물 분획 또는 fu를 계산합니다.

fu는 카세움으로 확산되어 약물 내성 마이코박테리아에 도달하는 데 사용할 수 있는 유리 약물을 반영합니다.

6.5마이크로리터의 준비된 테스트 화합물을 643.5마이크로리터의 균질염에 첨가합니다. 5마이크로몰과 와류의 최종 농도를 달성합니다.

그런 다음 빨간색 인서트를 베이스 플레이트에 놓습니다. 각 테스트에 대한 인서트, 각 화합물을 세 번 준비합니다.

200마이크로리터의 약물 스파이크 매트릭스를 각 빨간색 인서트의 빨간색 기증자 챔버에 추가합니다. 그런 다음 각 수신기 챔버에 350마이크로리터의 PBS를 추가합니다.

플레이트에 접착 씰을 놓고 섭씨 37도에서 열 혼합기에서 분당 200회전으로 4시간 동안 배양합니다. 배양 후, 위아래로 2-3회 피펫팅하여 기증자와 리시버 챔버의 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 각 기증자 챔버에서 20마이크로리터의 균질염을 1.5밀리리터 튜브의 20마이크로리터의 깨끗한 PBS로 옮깁니다.

유사하게, PBS 샘플의 20마이크로리터 분취량을 리시버 챔버에서 20마이크로리터의 깨끗한 균질산염으로 옮깁니다.

매트릭스 매칭을 사용하면 정량 분석을 위해 균질과 PBS에서 두 개의 개별 색각 곡선을 만들 필요가 없습니다. 기증실의 내용물은 시간이 지남에 따라 침전될 수 있습니다. 분취량을 제거하기 전에 피펫팅하여 내용물을 부드럽게 혼합하십시오.