박테리아의 항생제 지속성을 연구하기 위한 미세유체 타임랩스 현미경

형광 표지된 DNA 결합 융합 단백질을 발현하는 기하급수적으로 성장하는 박테리아 세포로 시작하여 뉴클레오이드를 시각화합니다.

미리 준비된 미세유체 플레이트의 세포 입구에 세포를 추가합니다.

다음으로, 항생제 함유 배지와 항생제가 없는 배지를 별도의 용액 입구에 도입합니다.

플레이트를 밀봉하고 현미경 스테이지에 장착하고 타임랩스 이미징을 시작합니다.

먼저 세포를 배양 챔버에 넣습니다.

그런 다음 항생제가 없는 배지를 챔버에 관류하여 기하급수적인 세포 성장을 지원합니다.

마지막으로 항생제 함유 배지를 소개합니다.

항생제는 이중 가닥 DNA 절단을 유도하여 민감한 세포를 죽입니다. 이 세포는 안정적인 형광을 가진 압축되고 복제되지 않는 뉴클레오이드를 나타냅니다.

회복을 촉진하기 위해 항생제가 없는 배지로 다시 전환하십시오.

항생제 치료에서 살아남는 작은 하위 집단인 지속성 세포는 DNA 복제를 재개하고 늘어나고 분열합니다.

이러한 회복은 지속성 세포의 형광을 증가시켜 감수성 세포와 시각적으로 구별할 수 있게 해줍니다.

미세유체 플레이트의 모든 웰에서 보존 용액을 제거하고 신선한 배양 배지로 교체합니다. 밀봉 버튼을 클릭하거나 미세유체 소프트웨어를 통해 매니폴드 시스템으로 미세유체 플레이트를 밀봉합니다.

그런 다음 미세유체 소프트웨어 인터페이스에서 Run Liquid Priming Sequence를 클릭하여 첫 번째 프라이밍 시퀀스를 수행합니다. 현미경 이미징을 시작하기 전에 섭씨 37도에서 최소 2시간 동안 온도 조절 현미경의 캐비닛에서 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 실험을 시작하기 전에 두 번째 액체 프라이밍 시퀀스 실행을 시작합니다.

미세유체 소프트웨어 인터페이스에서 Unseal Plate를 클릭하여 미세유체 플레이트를 밀봉합니다. 웰의 배지를 200마이크로리터의 신선한 배지, 항생제 함유 신선한 배지 및 신선한 배지의 0.01 OD 희석 배양 샘플로 교체합니다. 앞서 설명한 대로 미세유체 플레이트를 밀봉한 후 현미경 캐비닛 내부의 현미경 대물렌즈 위에 플레이트를 놓습니다.

미세유체 소프트웨어에서 Run Cell Loading Sequence를 클릭하여 세포를 미세유체 플레이트에 로딩할 수 있습니다. 투과광 모드를 사용하여 최적의 초점을 설정하고 필드당 최대 300개의 셀의 적절한 셀 수를 관찰할 수 있는 여러 관심 영역을 선택합니다. 미세유체 소프트웨어에서 사용자 정의 시퀀스 실행을 편집하여 6.9킬로파스칼의 신선한 배지를 웰 1과