Bacillus subtilis 포자의 생산 및 에어로졸 기반 증착

내성이 높은 포자 형성 박테리아인 Bacillus subtilis의 배양으로 시작하십시오.

배양액을 영양이 제한된 배지에 접종하고 포자 형성을 유도하기 위해 통기와 함께 배양합니다.

포자 형성 세포는 보호층이 있는 휴면 포자를 생성합니다.

배양액을 튜브로 옮기고 원심분리하여 포자를 펠릿화합니다. 잔류 세포와 파편이 포함된 상청액을 제거합니다.

펠릿을 멸균 증류수로 세척하고 원심분리를 반복한 다음 포자를 멸균수에 재현탁합니다.

위상차 현미경을 사용하여 밝은 포자를 식별하고 오염 물질이 없는지 확인하여 포자 순도를 확인합니다.

포자를 연속적으로 희석하고, 영양 한천에 플레이트를 바르고, 생존 가능한 포자가 콜로니로 발아할 수 있도록 배양합니다. 포자 농도를 결정하기 위해 콜로니를 세십시오.

이 농도에 따라 포자의 양을 조정하고 희석된 샘플을 에어로졸 노즐에 넣습니다. 현탁액이 빠르게 건조되어 얇고 균일한 포자 단층을 형성하는 멸균 유리 표면에 분사합니다.

포자 생산을 수행하기 위해, 적절한 항생제가 보충된 각각의 B.subtilis 균주의 5밀리리터의 하룻밤 배양액을 200밀리리터의 이중 강도 액체 쉐퍼 포자 형성 배지에 옮기고, 배양의 95% 이상이 포자가 형성될 때까지 최소 72시간 이상 섭씨 37도에서 격렬하게 폭기하여 배양한다. 15 밀리리터 튜브에서 3000 g에서 15 분 동안 원심 분리하여 포자를 수확하고 반복 세척 단계에서 멸균 증류 H₂O를 사용하여 샘플을 정제합니다.

위상차 현미경으로 순도 및 발아 상태를 확인하고 포자 현탁액이 위상 밝은 포자의 99% 이상으로 구성되어 있고 영양 세포, 발아된 포자 및 세포 파편이 없는지 확인하지 않으면 추가 현미경 실험이 방해받을 수 있습니다. LB 한천에 50마이크로리터의 10배 연속 희석액을 도금하여 CFU를 계산하고 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양하여 포자 역가를 결정합니다. CFU 측정 후, 농축하거나 멸균수를 사용하여 시료를 희석하여 시료를 밀리리터당 10개에서 9개의 포자로 조정합니다.

멸균된 미세한 슬라이드 또는 원형 25mm 커버 슬립 형태의 샘플 캐리어를 노즐과 정렬하여 전기적으로 작동되는 에어로졸 분무 장치 내부에 놓습니다. 포자 배양을 노즐 유체 입구로 옮기고 1.3bar의 압력으로 0.15초에 분무를 시작합니다. 분무된 포자 현탁액은 미세한 슬라이드에 박막을 형성하여 몇 초 안에 빠르게 건조되어 균일하게 분포된 포자 단층을 형성합니다. 처리된 샘플 캐