초파리 파리에서 장내 관련 박테리아의 군집 형성 단위의 정량화

초파리 파리에서 준비된 균질이 들어 있는 마이크로플레이트로 시작합니다. 이 파리는 장내에 특정 박테리아의 통제된 개체군을 품고 있었습니다.

균질에는 용해된 파리 조직과 방출된 장내 세균이 포함되어 있습니다.

부유 박테리아를 흡인하고 여러 마이크로플레이트에 걸쳐 연속적으로 희석합니다.

각 희석액에서 한천 플레이트에 소량을 찾아 물방울이 분리된 상태로 유지되도록 합니다.

박테리아가 눈에 보이는 콜로니로 증식할 수 있도록 배양합니다.

플레이트의 이미지를 캡처하여 개별 콜로니를 형성할 수 있는 생존 가능한 박테리아 세포의 수를 나타내는 콜로니 형성 단위(CFU)를 정량화합니다.

이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 기준선을 사용하여 각 이미지를 정렬하고, 경계를 정의하고, 균일한 그리드를 적용하여 각각 단일 지점에 해당하는 카운팅 영역으로 분할합니다.

밝기 임계값을 조정하여 개별 콜로니를 배경과 구별한 다음 분석을 실행하여 각 지점의 콜로니를 계산하고 CFU를 정량화합니다.

뚜껑을 열고 3개의 직사각형 MRS 한천 성장판을 생물안전 캐비닛에 넣어 최소 10분 동안 건조시킵니다. 96채널 피퍼터를 사용하여 멸균 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 PBS를 추가하여 두 개의 희석 플레이트를 준비합니다. P-20 팁 랙을 96채널 피스터에 로드합니다.

샘플 플레이트에서 11.1마이크로리터의 균질염을 흡인하여 1:10 희석을 만듭니다. 이제 웰당 100마이크로리터의 멸균 PBS가 들어 있는 첫 번째 희석판에 분배합니다. 희석판을 플레이트 셰이커에 600RPM에서 10초 동안 유지합니다.

위아래로 피펫팅하여 최소 10회 이상 혼합합니다. 첫 번째 희석 플레이트에서 두 번째 희석 플레이트로 11.1마이크로리터를 옮기고 추가 희석에 대해 혼합 단계를 반복합니다. 스포팅 플레이트의 경우 각 웰에서 96채널 피퍼터에 2마이크로리터를 로드합니다.

한천에 찔리지 않도록 피펫터 헤드를 플레이트 위로 천천히 내리고 모든 반점이 분배되었는지 확인합니다. 그런 다음 액체 반점이 한천에 빠르게 스며들고 함께 흐르지 않는지 확인하십시오. 원고에 설명된 대로 나머지 희석판에 대해 도금 과정을 반복합니다.

액체가 한천에 완전히 흡수되면 플레이트를 뒤집고 콜로니가 최적의 크기에 도달할 때까지 배양합니다. 플레이트를 논리적으로 정리하고 사진을 찍는 동안 특정 순서로 유지하세요. A1이 모든 플레이트의 왼쪽 상단 모서리에 있도록 방향을 지정합니다.

플레이트 뚜껑을 제거한 후 플레이트를 스테이지에 놓고 A1이 올바른 모서리를 향하도록 합니다. 플레이트를 이미지화합니다. 이미지를 컴퓨터로 전송하고 실험 이름, 미디어 유형, 희석 계수 및 기타 관련 세부 정보를 포함하여 이름을 바꿉니다.

정량화를 위해 처리할 이미지를 폴더로 구성합니다. 플레이트를 구별하는 파일 이름은 출력 스프레드시트의 각 개수 집합에 대한 열 제목이 됩니다. 폴더에 Cropped 및 Receipts라는 하위 폴더를 만듭니다.

이러한 폴더는 출력 파일을 수신합니다. 이제 ImageJ에서 Croptacular 플러그인을 실행하고 확인을 클릭하여 자르기를 시작합니다. 소스 폴더를 선택하는 대화 상자가 나타납니다.

확인을 클릭합니다. 소스 폴더를 선택하고 열기를 클릭합니다. 그런 다음 대상 디렉토리를 선택하기 위한 대화 상자에서 확인을 클릭합니다. 대상 폴더를 선택하고 열기를 누릅니다.

이미지가 이미 직선이면 스페이스를 누르기만 하면 됩니다. 그렇지 않으면 수평이 되어야 하는 가장자리를 따라 선을 그려 이미지를 곧게 펴십시오. 이미지가 직선으로 나타나지 않으면 필요한 만큼 선을 다시 그립니다.

그런 다음 계산 영역에 대한 경계 상자를 그리고 모든 지점이 셀 내에 있을 때까지 크기와 비율을 조정합니다. 커서를 경계 상자 외부로 끌어 그리드를 새로 고칩니다. 그리드가 좋아 보이면 스페이스를 누릅니다.

플러그인은 모든 사진이 동일하게 정렬된다고 가정하므로 다음 이미지가 첫 번째 이미지와 동일한 각도로 자동으로 회전하는지 확인하십시오. 이것이 정확하면 스페이스바를 눌러 계속합니다. 그렇지 않으면 이전과 같이 이미지를 똑바르게 합니다.

그리드는 또한 이전 이미지와 동일한 위치를 불러옵니다. 필요한 경우 조정하고 스페이스를 누릅니다. Count-On-It을 실행하고 Gridiron을 선택합니다.

상한 및 하한 픽셀 강도 값을 기준으로 임계값 콜로니 강도를 설정합니다. 임계값을 가능한 한 엄격하게 만들면서 모든 식민지를 선택합니다. 임계값이 만족스러우면 Action Required(작업 필요) 대화 상자에서 OK(확인)를 클릭한 다음 OK(확인)를 클릭하여 계속합니다.

첫 번째 이미지에는 설정 메뉴로 진행하거나 돌아갈 수 있는 옵션이 제공됩니다. 일괄 처리를 진행하려면 확인을 클릭합니다. 그런 다음 영수증 및 결과 테이블을 보관할 폴더를 선택합니다. 이전에 만든 영수증 폴더를 사용합니다.

첫 번째 이미지 이후의 다음 이미지는 기본적으로 이전 설정과 동일한 임계값으로 설정됩니다. 확인을 클릭하여 이러한 설정을 사용하거나 설정을 조정합니다.