JoVE 실험 백과사전
미생물학
0 조회수 • 3:08 분 • November 5th, 2025
금속이 고갈된 배지에서 성장한 Neisseria gonorrhoeaee 배양으로 시작합니다.
금속 희소성은 가능한 경우 금속 흡수를 시작하는 외막 수송체의 발현을 유발합니다.
미리 적신 니트로셀룰로오스 멤브레인을 젖은 여과지 위에 놓고 도트 블롯 장치를 조립합니다.
박테리아 세포를 찾아 액체가 흡수되도록 합니다.
장치를 분해하고 멤브레인을 제거한 다음 자연 건조하십시오.
비특이적 결합을 방지하기 위해 차단제를 추가합니다.
장치에 멤브레인을 다시 삽입하고 파라필름으로 밀봉한 다음 재조립합니다.
숙주 유래 금속 결합 리간드를 첨가하고 진흔하면서 배양합니다.
리간드는 박테리아 수송체에 결합합니다.
액체를 제거하고 멤브레인을 세척하여 결합되지 않은 리간드를 제거합니다.
리간드 특이적 1차 항체를 추가한 다음 효소 접합 2차 항체 및 유색 제품을 형성하는 비색 검출 시약을 추가합니다.
가시적 신호는 금속 제한 조건에서 박테리아 금속 수송체의 발현을 나타냅니다.
질량 배가 배양 후, 3부피의 CDM으로 배양액을 역희석합니다. 그런 다음 배양액을 섭씨 37도에서 4시간 동안 흔들어 배양합니다. 4시간 직전에 여과지 3장과 니트로셀룰로오스 1장을 도트 블롯 장치에 들어가는 데 필요한 대략적인 크기로 자릅니다.
니트로셀룰로오스 아래에 여과지로 장치를 조립하기 전에 니트로셀룰로오스를 탈이온수에 약 10분 동안 미리 담그십시오. 배양이 끝나면 세포 밀도를 기록하고 밀도를 적절한 최종 밀도로 표준화합니다. 그런 다음 세포 배양물을 니트로셀룰로오스 위에 피펫팅합니다.
여과지가 모든 액체를 흡수하면 장치를 분해하고 얼룩을 건조시킵니다. 적절한 차단 용액으로 1시간 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인을 차단하고 도트 블롯 장치를 재조립하고 여과지를 파라핀 필름으로 교체하여 니트로셀룰로오스 아래에 누출 방지 밀봉을 만듭니다. 관심 있는 금속 결합 리간드를 블로커에서 0.2마이크로몰로 희석하고 적당히 흔들면서 1시간 동안 세포를 조사합니다.
배양이 끝나면 진공으로 액체를 빨아들이고 블롯을 세척한 다음 표준 면역학적 절차에 따라 신호를 개발합니다.