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미생물학
0 조회수 • 3:38 분 • October 30th, 2025
GFP에 대한 유도 유전자와 분비 신호 태그가 있는 돌연변이 루시페라아제를 포함하는 Mycobacterium smegmatis 의 배양을 취하십시오.
돌연변이 유전자는 비활성 루시페라아제를 암호화하지만 단백질 합성 중 자연적인 오번역은 활성 효소를 생성합니다.
GFP는 루시페라아제 발현을 정상화하기 위한 내부 대조군 역할을 합니다.
유도제를 첨가하여 유전자 발현을 시작한 다음 배양액을 멀티웰 플레이트에 분취합니다.
선택한 웰에 테스트 분자의 농도를 증가시킵니다. 인큐베이트.
제어 조건에서 오번역은 활성 루시페라아제 분비를 초래합니다.
테스트 분자가 오번역을 억제하면 활성 루시페라아제 분비가 감소합니다.
배양 분취량을 블랙 플레이트로 옮기고 GFP 형광을 측정합니다.
원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
분비된 루시페라아제를 함유한 상청액을 옮기고 기질을 첨가하면 활성 루시페라아제가 산화를 촉매하여 발광을 생성합니다.
발광을 측정하고 루시페라제/GFP 비율을 계산합니다. 비율이 낮을수록 테스트 분자로 인한 오번역이 감소했음을 나타냅니다.
시작하려면 박테리아 리포터 균주를 7H9 배지 2밀리리터에 접종합니다.
섭씨 37도에서 1-2일 동안 또는 600나노미터의 OD가 고정상에 도달할 때까지 흔듭니다.
그런 다음 50밀리리터의 7H9 배지에서 계代배양하고 600나노미터의 OD가 후기 고정기에 도달할 때까지 성장시킵니다. 박테리아를 96웰 플레이트에 분취하기 전에 밀리리터당 50나노그램의 최종 농도로 ATC를 첨가하고 잘 혼합합니다.
웰당 100마이크로리터를 투명하고 바닥이 둥근 96웰 플레이트에 추가합니다. 다음으로, 선택한 웰에 다양한 용량의 Ksg를 추가하여 오번역률에 미치는 영향을 스크리닝합니다. 플레이트의 가장자리 웰에 200마이크로리터의 멸균수를 추가하여 샘플 웰에서 증발을 제한합니다.
플레이트를 밀봉하고 흔들어 샘플을 섭씨 37도에서 16-20시간 동안 유도합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에서 80마이크로리터를 채취합니다. 샘플을 바닥이 검은색인 96웰 플레이트로 옮기고 발광계로 GFP 신호를 측정합니다.
GFP 신호를 측정한 후 플레이트를 3,220배 g에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 50마이크로리터의 상청액을 바닥이 흰색인 96웰 플레이트로 옮깁니다.
그런 다음 각 웰에 50마이크로리터의 Nluc 기질을 첨가하고 잘 혼합한 다음 발광계로 발광을 측정합니다. 마지막으로, 보정된 Nluc 발광 값을 GFP 형광으로 나누어 Nluc/GFP 비율을 결정합니다.