Vibrio natriegens에서 조세포 추출물의 제조

세포 분해를 방지하기 위해 단백질 합성률이 높은 Vibrio natriegens의 현탁액을 냉각된 완충액에 넣으십시오.

추운 조건에서 원심분리합니다.

오염 물질을 제거하기 위해 상청액을 버립니다.

소량의 냉각된 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.

넓은 구경 팁을 사용하여 현탁액을 미세 원심분리기 튜브로 옮겨 기계적 전단을 방지합니다.

현탁액을 혼합하고 얼음 위에 놓인 홀더에 튜브를 놓습니다.

초음파 발생기 팁을 서스펜션으로 내립니다.

초음파 처리를 시작하여 세포막을 파괴하고 세포질 내용물을 방출합니다.

원심분리하여 불용성 세포 파편을 분리합니다.

세포질 내용물을 포함하는 상청액 또는 조세포 추출물을 신선한 튜브에 수집합니다.

세포 추출물을 액체 질소에서 급속 동결하여 생체 활성을 보존합니다.

무세포 단백질 발현에 추가로 사용할 수 있도록 초저온에서 보관하십시오.

갓 준비된 S30 용해 완충액 pH 7.7을 섭씨 약 4도로 식히고, 이 차가운 S30 용해 완충액 10밀리리터를 사용하여 동일한 1리터 배양액에서 생성된 모든 펠릿을 재현탁시키고 현탁액을 50밀리리터 튜브로 옮깁니다. 이 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 3,500배 g으로 원심분리한 다음 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인하여 얼음 위에 놓습니다.

냉장실에서 작업하면서 얼음 위에 놓인 50밀리리터 튜브의 펠릿에 500마이크로리터의 차가운 S30 용해 완충액을 추가합니다. 와이드 보어 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 재현탁하고 얼음 위에 있는 2밀리리터 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 매우 활동적인 원유 추출물을 생산하려면 세포가 S30 완충액으로 과도하게 희석되지 않았는지 확인해야하지만 효율적인 초음파 처리를 위해 충분한 액체가 있는지 확인해야 합니다.

600밀리리터 비커에 얼음을 채우고 얼음 위에 2밀리리터 튜브 홀더를 놓습니다. 튜브를 잠시 소용돌이쳐 세포를 균질화합니다. 캡 바닥의 세포를 넘겨 제거하고 캡을 연 상태에서 튜브 홀더에 넣습니다.

초음파 처리기 팁을 튜브의 세포 현탁액으로 내려 액체 표면 바로 아래에 오도록 합니다. 초음파 처리기와 팁 직경이 1/8 인치인 프로브를 사용하여 초음파 처리 설정을 준비합니다. 초음파 발생기를 20 킬로 헤르츠 주파수 및 50 % 진폭, 펄스 온 시간 10 초, 펄스 오프 시간 60 초로 설정합니다.

3 사이클 동안 펄스 초음파 처리 프로토콜을 실행하십시오. 그런 다음 용해물이 세포 파편이 없어질 때까지 섭씨 4도에서 30-45분 동안 조세포