0 조회수 • 4:37 분 • October 30th, 2025
사상성 시아노박테리아인 Phormidium lacuna의 배양을 취하십시오.
배양액을 균질화하여 필라멘트를 분산시킨 다음 원심분리하여 박테리아를 펠릿화합니다.
상청액을 버리고 펠릿을 영양이 풍부한 배지에 재현탁합니다.
녹색 형광 단백질과 항생제 내성 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 항생제가 보충된 한천 플레이트에 추가합니다.
DNA 위에 박테리아 현탁액을 첨가하고 빛 조건에서 배양합니다.
박테리아는 IV형 필리를 사용하여 DNA를 내재화합니다. 도입된 유전자는 박테리아 게놈의 여러 사본 중 하나에 통합됩니다.
형질전환된 박테리아를 선택하기 위해 항생제가 보충된 한천 플레이트에 박테리아를 재분배합니다.
광학 현미경으로 성공적인 변형을 나타내는 건강한 녹색 필라멘트를 식별합니다.
선택된 필라멘트를 항생제 농도가 더 높은 액체 배지로 옮겨 형질전환된 집단을 풍부하게 합니다.
다시 말하지만, 형질전환체를 분리하기 위해 항생제 수치가 더 높은 한천에 도금합니다.
형광 현미경으로 GFP 발현을 시각화하여 성공적인 형질전환을 확인합니다.
50밀리리터 액체 F2 배지를 250밀리리터 플라스크 각각에 실행 중인 배양에서 추출한 1밀리리터의 P. lacuna 필라멘트를 접종하는 것으로 시작합니다. 섭씨 25도에서 약 5일 동안 교반하면서 백색광으로 재배합니다.
5일 후, 100밀리리터의 P. lacuna 세포 현탁액을 10,000RPM에서 3분 동안 균질화하고 750나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 6,000배 g에서 15분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 펠릿을 800마이크로리터의 나머지 액체와 추가 F2+ 배지에 현탁시킵니다. 밀리리터 카나마이신당 120마이크로그램을 함유한 F2+ 박토 한천 플레이트 8개를 가져다가 각 한천 플레이트 중앙에 10마이크로그램의 DNA를 피펫팅합니다.
즉시 DNA 위에 100마이크로리터의 세포 현탁액을 피펫팅합니다. 과도한 액체가 증발할 수 있도록 뚜껑 없이 한천 플레이트를 클린 벤치에 보관하십시오. 접시를 닫고 섭씨 25도의 백색광에서 이틀 동안 재배합니다.
이틀 후, 각 한천 플레이트의 필라멘트를 접종 루프가 있는 밀리리터 카나마이신당 120마이크로그램을 포함하는 여러 개의 신선한 F2+ 박토 한천 플레이트에 분배합니다. 접시를 섭씨 25도의 백색광에서 배양하고 현미경으로 정기적으로 배양액을 확인합니다. 14-28일 후, 죽은 갈색 필라멘트를 식별하고 현미경으로 변형된 필라멘트를 찾습니다.
변형된 필라멘트는 건강하고 녹색으로 보이며 대부분의 필라멘트와 다릅니다. 변형된 각 단일 필라멘트를 밀리리터당 250마이크로그램의 카나마이신이 함유된 10밀리리터의 F2+ 배지가 포함된 50밀리리터 플라스크에 옮깁니다. 셰이커에서 섭씨 25도의 백색광에서 재배하고 최대 4주 동안 성장을 관찰합니다.
필라멘트를 밀리리터당 250마이크로그램의 카나마이신을 함유한 한천 배지로 다시 옮기고 필라멘트가 자랄 때까지 기다립니다. 그런 다음 카나마이신 농도를 다시 높여 분리 속도를 높입니다. GFP 발현의 경우 형광 현미경으로 단일 필라멘트를 40X 또는 63X 배율로 관찰하고 명시야 투과 이미지와 형광 이미지를 캡처합니다.